神经干细胞联合NT-3基因修饰的嗅鞘细胞移植对大鼠脑损伤后NGF蛋白表达的影响

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背景创伤性脑损伤(TBI)后相关部位会出现神经细胞的坏死、炎性反应以及神经营养因子的缺乏等改变,这些因素会导致患者出现难治性神经功能障碍。细胞移植的应用为改善脑损伤后神经功能障碍提供了新的希望。有研究表明神经干细胞(NSCs)联合神经营养因子3(NT-3)基因修饰的嗅鞘细胞(OECs)移植能改善TBI后神经功能受损情况。目的探讨NSCs联合NT-3基因修饰的OECs(NT-3-OECs)移植对大鼠TBI后神经生长因子(NGF)表达的影响。方法1.动物分组:选取成年SD大鼠100只随机分为五组:Sham组、TBI组、NSCs治疗组、NT-3-OECs治疗组、NSCs联合NT-3-OECs治疗组。2.OECs和NSCs的原代培养:从新生乳鼠脑组织的海马体及嗅球组织提取并培养NSCs和OECs。3.构建联合NT-3基因修饰的OECs:载有NT-3基因的慢病毒转染OECs,运用ELISA法检测培养皿中上清液NT-3的含量。4.造模与细胞移植:各组采用改良Feeney DM制作颅脑损伤模型。造模1 d后进行细胞移植,分别将10 ul相应细胞悬液或生理盐水注入损伤灶。5.大鼠神经功能缺损评分:按照大鼠改良神经功能缺损评分(m NSS)的标准,于移植后1d、7d、14d、28 d行评分,来评价大鼠神经功能缺损程度。6.HE染色:对各组大鼠麻醉,灌注,断头取脑,石蜡包埋脑组织,切片备用。按照说明书进行HE染色,镜下观察拍照。7.ELISA测定:取用移植后7 d的大鼠脑组织,ELISA法测定炎性因子IL-6、IL-1β及NGF蛋白的表达。8.免疫组化:通过免疫组织化学染色的方式检测移植后7 d的大鼠脑组织中p75、Nestin及NGF蛋白的表达。9.统计学方法:采用SPSS21.0统计软件分析,计数资料采用均值±标准差表示,两组间用t检验进行比较,多组间采用单因素方差进行比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.经过慢病毒转染后的OECs培养基中NT-3的含量高于未转染的OECs(P<0.05)。2.移植28d,联合组与TBI组、NSCs组、OECs组比较,m NSS评分降低(P<0.05)。3.移植28d,联合组较TBI组、NSCs组及OECs组比较,神经细胞排列相对规整,细胞肿胀减轻,空洞修复,核仁清晰。4.移植7d,与模型组、NSCs组、OECs组比较,联合组的IL-6、IL-1β表达水平降低(P<0.05),NGF蛋白含量增加(P<0.05)。5.移植28d,联合组中p75(标记OECs)及Nestin(标记NSCs)阳性的细胞分布范围更广。联合组的NGF阳性结果显著高于TBI组、NSCs组、OECs组(P<0.05)。结论NSCs和NT-3-OECs联合移植可通过提高NGF蛋白表达水平,减轻损伤灶区域炎症反应,促进神经功能恢复,从而达到神经保护和修复作用。
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