卵巢癌是一种严重威胁全球妇女生活和健康的恶性肿瘤，近几年来不论种族和地域卵巢癌的发病率都在不断攀升。在中国，每年有超过19.2万的女性诊断患有卵巢癌，平均有11.4万人死于该疾病，卵巢癌已经成为国内女性发病率第二、死亡率第一的恶性肿瘤。尽管医学技术的不断创新研究已经使卵巢癌的治疗有了飞速的发展，但是仍旧摆脱不了卵巢癌高致死率的现状。卵巢位于盆腔深部，前期缺乏特异性症状，常规的筛查手段又很有限，因此大约有60-70％的患者在确诊时已届晚期并且出现了广泛的腹腔内转移，究其原因在于早期诊断这个瓶颈多年来难以突破。最近有研究显示基因的易感性在肿瘤发生的早期阶段扮演了重要角色。因此，易感基因的筛查和鉴定将有助于建立卵巢癌的高风险人群和完善早期诊断，从而有利于提高卵巢癌患者的生存率。　　恶性肿瘤的生长和调控是受遗传、环境和生活方式等一系列因素综合作用的过程，这些复杂性疾病（包括肿瘤、心脑血管病、糖尿病等）的发生可能就是由许多低风险基因突变的累积效应从而增加了罹患疾病的风险。单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入，是人类基因组中是最常见的序列突变，由于涉及单个碱基的突变，它们可以影响编码序列、DNA剪切和转录调控。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×106个，具有大通量、高密度、分布范围广等特点。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变;从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易;有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNPs将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。因此，SNP将成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。　　p63和p73基因属于抑癌基因p53家族成员，主要参与细胞周期调控，转录活化和诱导凋亡等生物学过程。尽管具有相似的结构和功能，但每一个p53家族成员在肿瘤发生发展过程中都表现出不同的作用，或抑制或促进。值得注意的是，有研究结果显示在很多恶性肿瘤中都会检测到p63和p73基因不同亚基的高水平表达，这提示p63和p73基因的某些亚基可能具有原癌基因的作用，而不是扮演传统的抑癌基因的角色。此外，p63和p73基因具有调节人体卵巢内分泌功能和维护女性生殖细胞完整性的作用，二者的过表达可以产生协同效应使得正常卵巢组织向恶性转化并增强其侵袭转移的能力，从而导致卵巢上皮性肿瘤的发生。最近有研究显示，目前一种前沿的技术路线叫做全基因组关联分析(Genome WideAssociation Study，GWAS)，即通过提取病例组和正常组个体的基因组DNA，利用基因芯片做全基因组SNP分析，用统计学的方法找出两组个体之间有显著不同的SNP位点，从而将疾病的病因定位于那些SNP位点上，而具有那些SNP的基因变成那些疾病的“易感基因”。该方法将人类基因组和肿瘤疾病相关联，已经分析筛选出了成千上万个的遗传突变位点。因此，p63和p73基因由于遗传多态性使得它们在肿瘤发生发展过程中的生物学作用重新被认识并掀起了新的研究热潮。然而，对于p63和p73基因的多态性位点与卵巢癌易感性和临床病理学特征之间的关联还知之甚少。值得关注的是，有研究证实定位于p63和p73基因上的三个SNPs（rs873330T＞C、和rs4648551G＞A、rs6695978 G＞A）在不孕不育和体外人工受精患者中都存在特定等位基因明显的富集化现象。而不育和卵巢过度刺激综合征都是引起卵巢癌发生的主要高危因素，同时在治疗不育的方法中如人工授精，口服促排卵药物，在理论上都能够通过改变和打破体内激素的平衡状态从而增加卵巢癌发病的概率。还有研究表明，经过人工受精发育的孩子将来患恶性肿瘤的风险也会增高。　　基于上述关于不育与卵巢癌易感性之间的观察研究，本课题拟评价能否将已证实与不育相关的p63和p73基因的3个多态性位点(rs873330T＞C，rs4648551 G＞A和rs6695978 G＞A）作为卵巢癌早期预警和干预的生物学指标，通过分析卵巢癌患者与正常健康对照两组中上述位点的基因型频率分布情况，筛选与卵巢癌易感性、临床病理学特征以及预后关系密切的基因型，从而为高危群体的筛查、肿瘤相关基因的鉴定提供理论基础。此外，p73、p63的异常表达均可在卵巢上皮性肿瘤发生发展中起促进作用，但二者的相互关系国内外鲜见报道。本研究将对二者在卵巢上皮性肿瘤中的表达及相互关系进行探讨，为卵巢肿瘤的诊断及治疗提供相关参考指标，并且检测p63和p73蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其与临床病理特征之间的关系，探讨二者在卵巢上皮性肿瘤的发生发展预后中的作用、临床价值及二者的相关性。　　第一部分、p63和p73基因多态性与卵巢癌易感性、临床病理特征及预后的研究　　研究目的：p63和p73是抑癌基因p53的家族成员，在结构和功能方面与p53高度同源，由于遗传基因多态性所产生的不同基因型使得二者在肿瘤发生过程中的生物学作用再次引发了广泛的关注。最近有研究表明，p63(rs873330 T＞C)和p73（rs4648551 G＞A和rs6695978 G＞A）基因中的三个单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms，SNPs)位点与女性生殖相关联。在本研究中，我们将评估这些SNPs与卵巢癌的易感性和临床病理之间的关系，以及在体外p63和p73的不同基因型与二者基因表达水平的关联。　　研究方法：　　通过在卵巢癌患者和健康人群中对p63和p73基因三个单核苷酸多态位点（rs873330[GenBank登录，refSNP ID] T＞C[T:原始碱基，C:突变碱基，rs4648551G＞A和rs6695978 G＞A）的基因型频率进行分析，并研究不同基因型与卵巢癌的发病风险、临床病理特征以及预后的关系。通过提取样本的基因组DNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行测序和电泳检测，并在体外培养多种卵巢癌细胞株随后行上述三个位点的基因型测定，接下来采用Western-Blotting分析不同基因型的卵巢癌个体和细胞株中p63和p73基因的表达水平。应用SPSS16.0和Logistic回归模型进行统计分析。　　研究结果：　　结果显示，p73基因rs6695978 G＞A与卵巢癌易感性显著关联，该位点携带A等位基因的妇女比携带G等位基因者罹患卵巢癌的风险更高(OR=1.55，95％CI:1.07-2.19，p=0.003)。同时，A等位基因与卵巢黏液性囊腺癌(OR=3.48，95％CI:1.15-6.83，p=0.001)，低分化程度(OR=1.87，95％CI:1.03-3.47，p=0.003)，淋巴结转移(OR=1.69，95％CI:1.14-2.75，p=0.010)和雌激素受体阳性(OR=2.72，95％CI:1.38-4.81，p=0.002)呈正相关。生存分析结果表明，携带p73 rs6695978 G＞A位点中AA基因型的卵巢癌患者无病生存时间(Disease-FreeSurvival，DFS)缩短，而总生存时间(Overall Survival，OS)无明显变化。另外两个基因位点(rs4648551 G＞A，rs873330 T＞C)的多态性与卵巢癌的发病风险、临床病理特征和预后不相关。体外实验显示rs6695978 G＞A位点的AA基因型的卵巢癌个体和细胞株中p73基因表达水平较高;GG基因型的卵巢癌个体和细胞株中p73基因表达水平较低;AG基因型的卵巢癌个体和细胞株中p73基因表达水平居中。而rs4648551 G＞A，rs873330 T＞C位点的不同基因型的卵巢癌个体和细胞株中p63和p73在表达水平上没有统计学差异。　　研究结论：　　p73 rs6695978 G＞A的多态性将作为识别卵巢癌高危人群，实现早期诊断和评价预后的生物学指标。接下来我们也将进一步扩大样本研究并深入探讨p73基因rs6695978 G＞A多态性在卵巢癌发生过程中的相关机制。　　第二部分、p63和p73基因在卵巢癌中的表达及其与临床病理特征和预后的研究　　研究目的：卵巢癌是妇女最为常见的生殖系统癌症之一，相关研究表明多种原癌基因和抑癌基因参与卵巢癌的发生。p63和p73基因的异常表达与卵巢癌发生有密切的关系。本文主要对p63和p73基因在卵巢癌中的表达及其与临床病理特征之间的关系进行研究，探讨二者在卵巢癌的发生发展预后中的作用、临床价值及二者的相关性。　　研究方法：　　选取2009年1月至2010年12月之间于山东大学齐鲁医院临床资料完整、经手术切除并经病理证实的卵巢肿瘤组织标本103例。年龄分布区间为28-74岁。病例组包括卵巢良性肿瘤21例，卵巢交界性肿瘤25例，卵巢恶性肿瘤组57例;其中浆液性腺癌32例，粘液性腺癌11例，子宫内膜样癌8例，其他类型6例;按FIGO(International Federation of Gynecology and Obstetrics)临床-病理分期标准和WHO(World Health Organization)分级标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期7例，Ⅲ期34例，Ⅳ期8例。G1级7例，G2级13例，G3级37例。患者组术前均未接受过放疗、化疗和激素治疗。另取因其他疾病手术切除的正常卵巢组织16例（经病理证实为正常卵巢组织）作为对照。所有标本经10％甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，待行免疫组化检测。收集患者完整的临床信息（包括发病年龄、FIGO分期、病理类型、组织分化、淋巴结转移、是否存活等），应用SPSS16.0软件包对所得数据进行统计学分析。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，取得患者知情同意并签署知情同意书。　　研究结果：　　(1)p63蛋白在不同卵巢组织中的表达情况p63蛋白在正常卵巢组织中未见表达，在卵巢良性、交界性和恶性肿瘤组织中阳性表达率逐渐升高，p63蛋白在卵巢癌的阳性表达率明显高于正常卵巢组织和良性肿瘤，组间比较差异有显著性(p＜0.05);交界性肿瘤与正常组织比较，差异亦有统计学意义(p＜0.05);而正常组与良性组、良性组与交界性组、以及交界性组与恶性组比较差别均无统计学意义(p＞0.05)　　(2)p73蛋白在不同卵巢组织中的表达情况p73蛋白在正常卵巢组织中呈现低表达，随着卵巢良性、交界性和恶性肿瘤的进展其阳性表达率逐级递增，p73蛋白在恶性及交界性肿瘤中的阳性表达率明显高于良性肿瘤和正常卵巢组织，组间比较差异有显著性(p＜0.05); p73在卵巢癌中的阳性表达率高于其他三组，两两比较差异有显著性(p＜0.05);良性组与正常组间比较p73蛋白的表达率差异亦有统计学意义(p＜0.05)。　　(3)p63与卵巢癌临床病理学特征之间的关系p63蛋白的表达水平与卵巢癌不同病理类型、临床分期相关，即在浆液性腺癌组p63的表达阳性率明显高于其他组织类型，FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期患者中表达率明显高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差异有统计学意义(p＜0.05)。而与发病年龄、组织学分级和有无淋巴结转移无明显相关(p＞0.05)。　　(4)p73与卵巢癌组织临床病理学特征的关系p73蛋白的表达水平与卵巢癌不同组织学分级、临床分期相关，随着组织学分级和临床分期的升高，p73蛋白的阳性表达率也相应增高，低分化组(G3)明显高于中(G2)高(G1)分化组，Ⅲ-Ⅳ期也明显高于Ⅰ-Ⅱ期，差异有统计学意义(p＜0.05)。而p73蛋白的表达率在发病年龄、病理类型和有无淋巴结转移中无显著性差别(p＞0.05)。　　(5)p63和p73在卵巢癌组织中表达的相关性分析对p63与p73的蛋白表达情况进行Spearman相关分析，结果显示:p63与p73在卵巢癌中表达呈正相关，相关系数:Rs=0.403，p=0.000.　　(6)p63和p73蛋白表达对卵巢癌预后的影响采用Kaplan-Meier生存分析，结果显示p73蛋白表达阳性的卵巢癌患者较p73蛋白表达阴性者无病生存时间(Disease-Free Survival，DFS)和总生存时间(Overall Survival，OS)都明显缩短，差异有统计学意义(p＜0.05)。而p63蛋白表达阳性组和阴性组之间无进展生存时间(DFS)和总生存时间(OS)无显著性差别(p＞0.05)。　　研究结论：　　(1) p63和p73基因在卵巢恶性肿瘤中的表达水平显著高于交界性和良性肿瘤以及正常卵巢组织，提示p63和p73的高表达可能出现于卵巢癌形成过程中的早期阶段，对肿瘤从良性向恶性发展转化起到一定的促进作用。　　(2)在临床病理学参数中，p63和p73的蛋白表达均与卵巢癌的临床分期密切相关，p63的蛋白表达与卵巢癌的病理类型有关，p73的蛋白表达与卵巢癌中组织分化程度有关，提示p63和p73的异常表达参与了卵巢癌的发生发展，但作用机制可能不同。　　(3) p63和p73基因在卵巢癌的发生过程中起一定的协同作用。