恶性肿瘤是目前世界上最严重的公共健康问题之一。癌症的发病率和死亡率不断上升,已经成为了大多数地区的主要死亡原因。其中,前列腺癌严重威胁着中老年男性的健康,在全球男性肿瘤中所占的比例逐年增加。雄激素剥夺疗法（ADT）是前列腺癌的一线疗法,但随着治疗的进行,疾病会进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。第二代抗雄药物阿比特龙和恩杂鲁胺是目前比较常用的CRPC治疗药物,尽管二者均展现出一定的疗效,但患者长期服用之后又会出现再次耐药。因此,针对前列腺癌开发新的治疗策略和治疗方法仍然十分重要。在雄激素受体（AR）表达阳性的前列腺癌中,转录辅因子BRD4可以与AR相互作用并影响下游基因的转录,调控MYC、PSA、TMPRSS2-ERG融合基因等的表达,从而促进前列腺癌细胞的增殖,并与前列腺癌的去势抵抗、转移及不良预后密切相关,因此BRD4可作为AR-阳性前列腺癌的潜在治疗靶点。但传统的BRD4抑制剂往往选择性不佳,对BET家族蛋白包括BRD2、BRD3及BRDT均有不同程度的抑制活性,因此容易引起多种毒副反应;且药物作用时间不够持久,病人容易产生耐药。能够选择性持续下调BRD4表达水平或蛋白活性的小分子有望解决当前BRD4抑制剂的上述缺点。PROTAC（Proteolysis targeting chimeras）是一类两头含有不同配体的双功能分子,其通过一段合适长度的连接子（linker）将靶蛋白配体与E3泛素连接酶配体连接,能够将E3泛素连接酶招募至靶蛋白附近,催化靶蛋白发生泛素化降解。目前,大量的文献报道了针对多种疾病相关蛋白开发出的PROTAC分子,相比于普通的小分子抑制剂,PROTAC分子有以下一些优势:（1）药物通过降解蛋白质而不是抑制蛋白质功能发挥作用,因此药效更持久,活性更好;（2）一分子化合物往往可以诱导多分子蛋白发生降解,因此在亚化学计量的药物浓度下就能使目标蛋白被充分降解,药物的有效剂量更低,安全性可能更好;（3）药物分子不需要与靶蛋白的功能结构域结合就可以发挥蛋白降解作用,因此PROTAC分子可以针对此前不能成为药靶的蛋白开发成药,如细胞骨架蛋白或转录因子;（4）E3泛素连接酶与靶蛋白的相互作用可以使以PROTAC分子相比于传统小分子药物具有更高的选择性,因此能够在一定程度上避免传统药物脱靶效应引起的安全性问题,PROTAC分子的这些优势使得其特别适合开发成为抗肿瘤药物。本课题组此前致力于开发BET/PLK1双靶点抑制剂并将其用于肿瘤的治疗,在前期研究中已设计并合成了一大类[1,2,4]三唑并[4,3-f]蝶啶类衍生物,并从中优选出新型BET/PLK1双靶点抑制剂WNY0824,该化合物能够通过同时抑制BET家族和PLK1蛋白的功能来阻断二者所调控的多个信号通路,并在体内外对急性髓性白血病及去势抵抗性前列腺癌展现出良好的抗肿瘤作用,鉴于该化合物对BET和PLK1的抑制活性还不够理想,本论文基于WNY0824的分子结构设计了一系列PROTAC分子,以期找到对BET及PLK1均具有蛋白降解活性的双靶向PROTAC分子。但在构效关系研究中我们意外发现基于WNY0824所设计的PROTAC分子能够高选择性的降解BRD4蛋白,而对BET家族其他蛋白及PLK1无显著降解活性。本论文详细考察了最优分子WWL0245在去势抵抗性前列腺癌中的抗肿瘤活性及作用机制,并对比了其与BET/PLK1双靶点抑制剂WNY0824在作用机制上的区别。1.基于BET/PLK1双靶点抑制剂设计、发现高活性BRD4-PROTAC分子WWL0245首先,本论文以WNY0824为靶蛋白配体,以CRBN配体沙利度胺、来那度胺及VHL配体VH032为E3泛素连接酶配体,以不同长度的烷基链或聚乙二醇链为连接子,设计合成了一系列PROTAC分子,经过初步的细胞增殖抑制活性筛选及蛋白降解活性筛选,从中得到了多个对MV4-11及A2780细胞具有良好增殖抑制活性且能显著降解BRD4蛋白的活性分子。其中最优分子WWL0245对多种BRD4依赖性肿瘤细胞展现出了良好的细胞增殖抑制活性,而对BRD4非依赖性肿瘤细胞的增殖抑制活性较弱,提示其可能选择性靶向BRD4。本论文随后选择WWL0245在AR阳性及阴性的去势抵抗性前列腺癌细胞中进行了深入的药效学评价及作用机制研究。2.WWL0245在前列腺癌细胞中的体外药效学研究本论文首先考察了WWL0245对于具有不同AR表达情况的五种前列腺癌细胞株（包括AR-阳性的CRPC细胞株VCa P,22Rv1、AR-阳性的激素敏感性前列腺癌细胞株LNCa P及AR-阴性的CRPC细胞株PC-3,DU145）的增殖抑制能力,与双靶点BET/PLK1抑制剂类似,该化合物对于AR阳性的细胞株展现出了较强的增殖抑制活性(对于VCa P,22Rv1,LNCa P的IC50分别为16.0 n M、20.8 n M及52.9 n M),但是对AR阴性的细胞株活性较差(对于PC-3,DU145的IC50分别为2.435μM,＞10μM),提示该分子对AR-阳性的CRPC具有潜在的治疗用途。WWL0245也能显著抑制22Rv1集落形成,甚至在低于WNY0824十倍的浓度下就能达到与其相同的抑制效果。WWL0245和WNY0824处理肿瘤细胞三天后停药并继续培养,在停药8天后WWL0245还能持续抑制AR阳性CRPC细胞的增殖,并且在100 n M浓度下其抑制效果优于1μM浓度的WNY0824。3.WWL0245在前列腺癌细胞中的BRD4蛋白降解活性及选择性研究本论文进一步考察了WWL0245在前列腺癌细胞中对PLK1及BET家族蛋白的降解能力以及对c-Myc表达的调控能力,WWL0245能以时间/浓度依赖性降解BRD4并下调c-Myc的表达,其在AR阳性的去势抵抗性前列腺癌细胞22Rv1,VCa P中DC50达到0.36 n M及0.07 n M,且Dmax＞99%。尽管WWL0245对BRD2/BRD3保持了与BRD4相似的亲和力,但在最高浓度1μM作用下其对BRD2/BRD3的蛋白水平并无明显影响,提示其对BRD4具有选择性降解作用。WWL0245对PLK1也具有亚微摩尔抑制活性,但其在所有测试浓度范围内对PLK1水平均无显著的下调作用,结合其对BET家族蛋白的降解选择性,推测通过选择合适的E3配体和连接子,多靶点小分子化合物可被设计开发成高选择性PROTAC蛋白降解分子。4.WWL0245诱导BRD4降解及抑制AR-阳性前列腺癌细胞增殖的作用机制研究最后,本论文考察了WWL0245诱导蛋白降解和抑制细胞增殖的具体作用机制,BET/PLK1抑制剂WNY0824、BET抑制剂JQ1、CRBN配体来那度胺、蛋白酶体抑制剂MG-132及NAE抑制剂MLN-4924均能不同程度的逆转WWL0245对BRD4的降解作用,说明WWL0245对BRD4的下调依赖于其与BRD4和CRBN的结合,且其对BRD4的下调依赖于蛋白酶体系统的泛素化降解作用。WWL0245能显著下调前列腺癌中关键蛋白AR、PSA的蛋白水平并抑制下游基因的转录,其也能浓度依赖性的诱导细胞发生凋亡,并且在相同浓度下对AR、PSA蛋白水平的下调作用和凋亡诱导效应均显著优于WNY0824。此外,WWL0245能将细胞周期阻滞在G0/G1期,说明其主要通过降解BRD4发挥细胞周期阻滞作用,而WNY0824则主要通过抑制PLK1而将细胞周期阻滞在G2/M期,提示二者发挥抗肿瘤作用可能具有不同机制。综上所述,本论文通过一个温和的多靶点抑制剂WNY0824开发出了一个高降解活性、高选择性的BRD4-PROTAC分子WWL0245,并证实了其在AR-阳性前列腺癌细胞中通过高效降解BRD4蛋白能够发挥相比WNY0824更好的抗肿瘤活性。WWL0245因此有望被进一步开发成为新型抗前列腺癌候选药物。此外,作为一种高选择性高活性BRD4蛋白降解分子,WWL0245亦可作为良好的工具分子用于探索BRD4的生理功能。