目的机体天然免疫系统在抵御HIV感染中发挥重要作用,APOBEC3G（Apolipoprotein B mRNA-editing Enzyme,Catalytic Polypeptide-like 3G）是新发现的细胞内天然免疫因子,具有抑制HIV Vif缺失病毒（HIVΔvif）复制的能力。Vif（Virion Infectivity Factor）是HIV-1病毒的调节蛋白之一,以细胞依赖方式在新生病毒的组装、释放或者成熟阶段增加其感染性。体外实验显示,APOBEC3G通过诱导HIVΔvif病毒逆转录过程中生成的cDNA,将胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,诱导病毒基因组DNA的致死性突变而抑制病毒复制。但当病毒Vif蛋白存在时,可通过阻止APOBEC3G组装入病毒颗粒以及诱导泛素化降解等途径来拮抗APOBEC3G。当Vif重要氨基酸位点发生改变时,其对APOBEC3G的降解作用明显减弱或完全丧失。目前,APOBEC3G在HIV感染者体内的表达水平、作用及与疾病进展的关系尚不明确。HIV感染者体内病毒Vif变异与APOBEC3G表达水平之间关系的相关研究尚未见报道。我国HIV感染者的遗传背景、免疫特性、感染病毒亚型和主要感染途径均不同于国外,目前尚无中国HIV感染者APOBEC3G和病毒Vif的研究。因此,本课题首次对中国不同疾病进展阶段的HIV/AIDS患者外周血单个核细胞APOBEC3G表达水平和HIV-1病毒Vif基因序列进行了研究,初步探讨APOBEC3G表达水平、Vif基因变异与HIV疾病进展的关系,以及Vif氨基酸取代变异对APOBEC3G表达水平的影响,并结合体外实验,探讨IFN-α对APOBEC3G表达水平的调节作用,为筛选延缓我国HIV/AIDS患者疾病进展的天然免疫因子,为HIV的疫苗设计及治疗提供有价值的理论依据。方法1、研究对象由河南省疾病预防与控制中心以及中国医科大学艾滋病研究所艾滋病确认实验室经Western blot试验确认为阳性,未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者。调查与采血前征得患者同意,并签订知情同意协议。患者血浆标本病毒核酸经套式聚合酶链反应扩增gag-pol区,序列测定和分析确定为B′亚型。根据HIV/AIDS患者感染时间和CD4⁺T细胞数量分为缓慢进展组（Slow Progressor,SP）:感染时间＞10年,未经抗病毒治疗,CD4⁺T细胞数量＞500个/μl;典型进展HIV组（HIV）:感染时间＞5年,CD4⁺T细胞数量介于200～500个/μl,无艾滋病指征性疾病;典型进展AIDS组（AIDS）:感染时间＞5年,CD4⁺T细胞数＜200个/μl,和/或合并艾滋病指征性疾病。HIV抗体阴性健康对照来自河南省。2、CD4⁺T淋巴细胞计数应用美国BECTON DICKINSON公司的流式细胞仪（FACSCALIBUR）测定CD4⁺、CD8⁺、CD3⁺T淋巴细胞绝对值。将20μl CD4/CD8/CD3 TRITEST试剂加入CD4绝对计数管,加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素45μl,室温避光15min,FACSMULTISET软件检测并进行自动分析。3、病毒载量测定用200μl病人血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司HIV-1Monitor 1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。HIV病毒载量经log₁₀对数转化后用于统计分析。4、标准品质粒的构建取健康人EDTA抗凝全血5ml,常规提取外周血PBMC。采用Qiagen公司的RNeasy mini kit提取细胞总RNA。取1μg总RNA,按照Promega公司的ImProm-Ⅱ^TMReverse Transcription System说明书逆转录合成cDNA。PCR扩增APOBEC3G和GAPDH开放读码框架全长,PCR产物经回收纯化后克隆到pGEM-T载体,转化到DH5α感受态菌中,蓝白筛选后获得阳性克隆,测序验证,纯化重组质粒,紫外分光光度计定量后根据分子量换算为分子拷贝数,10倍系列稀释质粒制备质粒标准品。5、实时定量PCR检测APOBEC3G mRNA水平取健康对照和HIV感染者EDTA抗凝全血10ml,常规提取外周血PBMC。采用Qiagen公司的RNeasy mini kit提取细胞总RNA。选用Promega公司的ImProm-Ⅱ^TM Reverse Transcription Systerm和随机引物逆转录合成cDNA。APOBEC3G（NM₀21822）和内参GAPDH（NM₀02046.3）特异性探针序列为FAM-GCAACCAGGCTCCACATAAACACGG-NFQ:FAM-GGACTCATGACCACAGTCCATGCCA-NFQ。25μl实时PCR反应体系:2×TaqMan^? Universal PCR Master Mix 12.5μl,20×TaqMan Gene Expression Assay 1.25μl、无RNase/DNase水9.25μl、cDNA2μl。应用ABI 7500实时PCR仪进行检测,反应条件50℃2min,95℃10min,95℃15s、60℃1min 40循环。APOBEC3G和GAPDH mRNA绝对拷贝数由系列稀释的质粒构建的标准曲线获得,每份标本设2个复孔结果取均值。6、Western blot方法检测PBMC中APOBEC3G蛋白量将PBMC置于冰上,加入裂解液,充分裂解细胞后,4℃,12000rpm/min离心20min,将上清吸到另一个Eppendorf管中,Lowry法蛋白定量。加入3×上样buffer混合,煮沸5分钟,冷却后取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳。然后通过半干式转印到硝酸纤维素膜上,脱脂奶粉封闭,按预染标记的分子量剪裁转印膜,分别加入兔抗人APOBEC3G（1:200）、GAPDH（1:2000）一抗,37℃孵育1h,4℃过夜,洗膜,加入HRP标记的羊抗兔二抗,37℃30min,ECL发光显色,图像采集及分析处理。7、套氏聚合酶链反应（Nest-PCR）扩增HIV-1前病毒Vif全长及序列分析（1）套氏聚合酶链反应（Nest-PCR）扩增HIV-1前病毒Vif基因取每例感染者全血1ml,应用QIAamp Blood kit（Qiagen）提取前病毒基因组DNA。取5μlDNA进行Nest-PCR扩增。外侧引物序列为Pol5:GAAGCCATGCATGGACAGGT,Vif2:AGGCTGACTTCCTGGATG。内侧引物序列为Vif3:CATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAG,Vif4:TCTTAAGCTCCTCTAAAAGCTC。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳,经与marker比对,确认所需片段,用QIAquik Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。将纯化后的PCR产物,以Vif3、Vif4为测序引物,使用美国Applied Biosystem公司的BigDye TerminatorSequencing试剂盒和ABI 377型DNA测序仪进行测序。（2）Vif核苷酸和氨基酸序列特征分析下载HIV序列库（http://www.hiv.lanl.gov）中各亚型国际、国内HIV-1Vif序列,用BIOEDIT软件包中CLASTAL W程序对下载序列及测得序列进行排列比对。以phylogeny工具邻位相连法（Neighbor-Joining）生成系统进化树。使用Translation程序将核苷酸序列翻译成蛋白质的氨基酸序列并与标准序列进行比对,分析各氨基酸位点的变化。8、体外SF33感染PBMC和IFN-α刺激实验Ficoll密度梯度离心法分离健康人和HIV感染者PBMC,常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中（37℃,5%CO₂）。实验组细胞分别感染500TCID₅₀的SF33和/或加入终浓度为100U/ml、400U/ml、800U/ml的IFN-α,于培养不同时间点收集培养上清于-20℃冻存,用于p24检测;同时收集孔内细胞于15ml离心管,1000rpm/min离心10分钟,PBS洗涤2次,弃尽上清,分别提取细胞总RNA和蛋白,用于APOBEC3G的mRNA和蛋白检测。9、培养上清p24检测采用Biomerieux公司p24ELISA检测试剂盒,严格按照说明书操作。10、统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。计量资料结果以均值±标准差表示,病毒载量经log₁₀对数转换后用于统计学分析。研究对象不同分组APOBEC3G表达差异采用单因素方差分析,并进行均数两两比较;表达水平与CD4⁺T细胞数量、病毒载量的相关性采用Pearson相关分析。组间氨基酸取代频率的差异比较采用Fisher’s精确概率检验。氨基酸位点有无取代两组间CD4⁺T细胞数和病毒载量的组间比较采用均数t检验。结果1、HIV/AIDS患者外周血单个核细胞APOBEC3G mRNA水平HIV/AIDS患者和健康对照PBMC中APOBEC3G mRNA表达水平:HIV/AIDS患者显著低于健康对照组（P＜0.05）;SP组显著高于HIV组和AIDS组（P＜0.05）;HIV组和AIDS组mRNA表达水平无统计学差异。PBMC。中APOBEC3G蛋白表达水平:HIV组和AIDS组显著低于健康对照组和SP组;SP组和健康对照组、HIV组和AIDS组APOBEC3G蛋白表达组间差异无统计学意义（P＞0.05）。2、HIV/AIDS患者外周血单个核细胞APOBEC3G mRNA水平和蛋白含量的相关性分析HIV/AIDS患者PBMC中APOBEC3G mRNA水平与蛋白含量显著正相关（r=0.801,P＜0.001）。3、HIV/AIDS患者APOBEC3G mRNA表达水平与CD4⁺T细胞数和病毒载量的相关性HIV/AIDS患者APOBEC3G mRNA表达水平与CD4⁺T细胞数量显著正相关（r=0.436,P=0.002）,与HIV-1病毒载量显著负相关（r=0.306,P=0.038）。4、Vif与APOBEC3G作用位点氨基酸序列分析HIV/AIDS患者病毒Vif序列中除中央亲水区E88WRKKR93个别氨基酸有取代发生外,其余各功能区氨基酸序列均较保守。在E88WRKKR93基序中第92位氨基酸呈现多态性,该位点氨基酸改变不影响APOBEC3G表达水平。5、Vif其它位点的氨基酸序列分析HIV/AIDS患者病毒Vif氨基酸序列中V7A取代与低病毒载量、高CD4⁺T细胞数有关;而F39V取代与高病毒载量、低CD4⁺T细胞数有关。该位点氨基酸改变不影响APOBEC3G表达水平。6、IFN-α对PBMC中APOBEC3G表达影响的体外研究IFN-α明显上调正常人PBMC中APOBEC3G mRNA和蛋白表达水平,且与IFN-α浓度存在剂量依赖关系;感染SF33毒株的正常人PBMC在IFN-α作用下,其细胞内APOBEC3G表达量与对照组比较明显增加,培养上清p24含量明显下降;从HIV感染者分离的PBMC在IFN-α作用下,细胞内APOBEC3G表达水平与对照组比较明显增高,培养上清p24含量明显下降。结论1、中国HIV/AIDS患者外周血单个核细胞APOBEC3G表达水平与疾病进展密切相关;高水平的APOBEC3G对感染HIV后疾病缓慢进展具有保护作用。2、中国HIV/AIDS患者HIV-1Vif与APOBEC3G作用的重要氨基酸位点相对保守。Vif序列中V7A取代与低病毒载量、高CD4⁺T细胞数有关;F39V取代与高病毒载量、低CD4⁺T细胞数有关。该位点氨基酸改变不影响APOBEC3G表达水平,提示F39V取代和V7A取代可能是与APOBEC3G表达水平无关的影响疾病进程的病毒学因素。3、IFN-α能够诱导HIV感染者PBMC中APOBEC3G mRNA和蛋白的表达,且与病毒复制抑制密切相关。