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目的:牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）是指利用骨痂愈合作用机制使DO牵张间隙内新生骨组织快速生成的内源性骨组织工程技术。DO新骨形成的速度不仅明显领先于生长发育高峰期的婴幼儿,甚至超越了部分恶性肿瘤的生长速度。但是DO较长的疗程以及并发症限制了DO的发展。在临床上采用何种方式能简便、有效的提高DO新生骨形成的速度和质量,减少并发症且有效缩短DO疗程,是目前亟待解决的问题。课题组在前期研究中,证实了传统中药三七的主要活性提取物三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins,PNS）可以上调兔骨髓间充质干细胞（Rabbit Bone Mesenchymal Stem Cells,r BMSCs）以及DO牵张间隙新生骨组织转化生长因子β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）表达,促进r BMSCs的成骨功能及DO新生骨组织质量。TGF-β1信号传导刺激在胚胎骨发育过程和机体骨稳态中起到重要作用。探索PNS调控TGF-β1信号传导机制将为临床中应用PNS促进DO治疗提供理论基础。方法:1.PNS通过TGF-β1/Smads信号传导调控r BMSCs成骨功能的机制研究:分离培养原代r BMSCs。细胞形态学观察、流式细胞仪检测细胞CD44、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR阳性率以及茜素红染色检查成骨分化功能完成鉴定。设三个实验组,空白对照组（NC）、PNS诱导组（P）、阳性对照组（PC）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）法描绘各组细胞的生长曲线并观察r BMSCs形态的变化。各实验组分别诱导21d后行茜素红染色法（Alizarin Red Staining,ARS）。流式细胞仪检测各实验组诱导8d后的细胞周期变化。免疫荧光法检测r BMSCs中TβR-Ⅱ、Smad2、Smad3、PPM1A、Ran BP3的表达及定位。实时荧光定量PCR法（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）、蛋白质印迹法（Western-Blot,WB）检测各实验组诱导3d、6d、12d后TβR-Ⅱ、Smad2、Smad3、PPM1A、Ran BP3的表达情况;2.过表达r BMSCs中TβR-Ⅱ,进一步探索PNS通过TGF-β1/Smads信号传导调控r BMSCs成骨功能的机制:设计构建慢病毒介导的TβR-Ⅱ过表达载体Lv-TβRⅡ,筛选病毒转染r BMSCs的最适感染复数（Multiplicity of Infection,MOI）,q RT-PCR法和WB法验证TβR-Ⅱ过表达量。设立四个实验组,空白对照组（NC）、PNS诱导组（P）、PNS诱导阴性过表达病毒对照组（P+Lv-Control）及PNS诱导过表达病毒组（P+Lv-TβRⅡ）。CCK-8法描绘病毒转染后r BMSCs生长曲线。ARS法检测过表达TβR-Ⅱ对r BMSCs成骨功能的影响。q RT-PCR法和WB法检测各实验组诱导12d后TβR-Ⅱ、Smad2、Smad3、PPM1A、Ran BP3的表达变化;3.沉默r BMSCs中TβR-Ⅱ,进一步探索PNS通过TGF-β1/Smads信号传导调控r BMSCs成骨功能的机制:设计构建慢病毒介导的TβR-Ⅱ沉默载体Lv-sh TβRⅡ,筛选病毒最适MOI,q RT-PCR法和WB法验证r BMSCs转染病毒后TβR-Ⅱ沉默效率。设立四个实验组,空白对照组（NC）、PNS诱导组（P）、PNS诱导阴性沉默病毒对照组（P+Lv-sh Control）及PNS诱导沉默病毒组（P+Lv-sh TβRⅡ）。CCK-8法描绘病毒转染后r BMSCs生长曲线。ARS法检测沉默TβR-Ⅱ对r BMSCs成骨功能的影响。q RT-PCR法和WB法检测各实验组诱导12d后TβR-Ⅱ、Smad2、Smad3、PPM1A、Ran BP3的表达变化;4.PNS通过TGF-β1/Smads信号传导促进兔DO新骨形成的作用机制研究:设立六个实验组:对照组（NC）;PNS肌肉注射组（P）;Matrigel基质胶对照组（P+Matrigel）;BMSCs对照组（P+BMSCs）;TβR-Ⅱ阴性病毒对照组（P+Lv-Control）;TβR-Ⅱ过表达病毒组（P+Lv-TβRⅡ）,构建右下颌骨DO模型。各实验组又按固定时间分为固定0周组及固定2周组,期间按各组实验方法处理实验兔,获取下颌骨牵张区标本。CBCT检查DO是否成功及牵张间隙打开情况。扫描电镜检查PNS作用下牵张间隙组织学改变及过表达TβR-Ⅱ对牵张间隙组织学影响。能谱仪分析检测各组牵张间隙内钙磷质量比,比较新生骨组织质量。q RT-PCR法、WB法检测各组牵张间隙TβR-Ⅱ、Smad2、Smad3、PPM1A、Ran BP3的表达变化及随固定时间的变化趋势。结果:1.PNS通过TGF-β1/Smads信号传导调控r BMSCs成骨功能的机制研究:分离培养细胞形态与增殖特点与r BMSCs相符。细胞表面高表达CD44、CD90、CD105,低表达CD34、CD45和HLA-DR,符合r BMSCs表面标记特征。细胞经ARS出现钙结节,表明具有成骨分化能力。证实所获细胞为r BMSCs。CCK-8法结果显示PNS对r BMSCs的增殖无明显影响（P>0.05）。PNS诱导r BMSCs 8d后,r BMSCs出现成骨细胞样形态变化,同时细胞周期结果提示8d时PNS将r BMSCs阻滞于G1期,促进BMSCs分化。PNS诱导21d后,ARS显示钙结节数量PC>P>NC（PP>NC（P<0.05）,并且随着诱导时间的增加表达量逐渐上升（P<0.05）,而PPM1A、Ran BP3的表达量则为PC0.05）。ARS结果显示过表达TβR-Ⅱ不影响r BMSCs细胞的成骨分化功能,且钙结节数量为NC0.05）。ARS结果显示沉默TβR-Ⅱ不影响r BMSCs细胞的成骨分化功能,且生成钙结节数量为P+Lv-sh TβRⅡ
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