研究背景:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是糖尿病（diabetic mellitus,DM）患者常见的血管并发症,动脉粥样斑块破裂及血栓形成是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病状态加速晚期糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）的生成,后者可通过增加氧化应激及激活炎症因子等机制加速AS进展。单核巨噬细胞是AS起始及发展过程中的主要炎症细胞,且具有表型极化的能力。根据其活化状态以及功能的不同,巨噬细胞主要分为经典活化型巨噬细胞（M1型）和替代活化型巨噬细胞（M2型）。M1型巨噬细胞分泌多种促炎细胞因子和趋化因子,如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis facor alpha,TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）和白细胞介素-6（interleukin 6,IL-6）,在促炎反应中起重要作用;M2型巨噬细胞通过分泌免疫抑制性细胞因子,如白细胞介素-4（interleukin 4,IL-4）,白细胞介素-10（interleukin 10,IL-10）和精氨酸酶1（arginase 1,Arg1）,抑制炎症并修复组织。近年来,巨噬细胞极化在心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）,尤其是动脉粥样硬化研究领域中取得了重要进展。M1型巨噬细胞加速斑块形成并增加斑块不稳定性,而M2型巨噬细胞在保持斑块稳定中发挥重要作用。研究发现,AGEs可以促进巨噬细胞向M1型极化,但其具体机制尚不明确。能量代谢方式转换是巨噬细胞极化的重要节点,M1型巨噬细胞的糖代谢以糖酵解为主。低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1-α,HIF-1α）在糖酵解中起关键作用,而巨噬细胞糖酵解和促炎激活主要依赖HIF-1α途径。我们前期研究发现AGEs可促进血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的无氧糖酵解。以上提示AGEs对巨噬细胞极化的调控可能依赖于糖代谢方式的转换,HIF-1α可能参与其中。丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinases,PDKs）有四种同工酶,PDK1-4通过磷酸化丙酮酸脱氢酶复合体（pyruvate dehydrogenase complex,PDC）丝氨酸残基不同位点抑制PDC活性,抑制三羧酸循环。黑色素瘤细胞系中,HIF-1α可以调控PDK4表达。同时PDK2/4与外周巨噬细胞向M1型的诱导有关。因此,我们推断PDK4可能参与AGEs/HIF-1α诱导巨噬细胞向M1型极化的过程。另外,AGEs与细胞表面特异性晚期糖基化终产物受体（the receptor of advanced glycation endproducts,RAGE）结合后诱导氧化应激,激活转录因子核因子-κB（nuclear factor-kappa beta,NF-κB）,促进炎症因子和趋化因子等动脉粥样硬化相关基因表达,参与糖尿病血管并发症进展。激活蛋白-1（activator protein 1,AP-1）、孤核受体77（orphan nuclear receptor 77,Nur77）、干扰素调节因子5/8（interferon regulatory factor 5/8,IRF5/8）和NF-κB等关键转录因子同样调控巨噬细胞M1/M2极化。综合以上研究背景,本研究提出以下研究假说:1.AGE-BSA通过HIF-1α/PDK4通路促进巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化;2.氧化应激参与AGE-BSA经HIF-1α/PDK4通路诱导巨噬细胞向M1型极化过程;3.PDK4通过调控与巨噬细胞极化相关的关键转录因子表达促进AGE-BSA处理的巨噬细胞向M1型极化。研究方法:1.AGE-BSA制备葡萄糖与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）37℃避光孵育90天制得AGE-BSA,BCA法检测蛋白浓度。2.在体观察AGEs和巨噬细胞极化apoE^-/-小鼠腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin,STZ）+左侧颈动脉部分结扎术（partial left carotid artery ligation surgery,PLCA）+高脂饮食构建糖尿病颈动脉粥样硬化模型。HE染色观察斑块大小;ELISA法检测血浆AGEs,TNF-α、IL-6和IL-10各细胞因子水平;实时定量PCR（quantitativereal-time PCR,qPCR）、蛋白质免疫印迹（western blotting,WB）检测斑块组织中M1型巨噬细胞标记iNOS和M2型巨噬细胞标记Arg1的mRNA和蛋白表达。3.AGE-BSA对巨噬细胞极化的影响不同浓度梯度（50,100,200和400μg/mL）以及时间梯度（0,12,24,48和72小时）的AGE-BSA处理小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）,ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的分泌情况;qPCR检测iNOS、Arg1、HIF-1α和PDK4的mRNA表达;western blotting检测iNOS、Arg1、HIF-1α和PDK4蛋白表达。4.siHIF-1α与AGE-BSA诱导的巨噬细胞极化设计、合成三条特异性针对HIF-1α的小干扰RNA（siHIF-1α）,然后通过Lipo-2000将三条siHIF-1α以及对照小RNA（Control siRNA,siNC）转染RAW264.7细胞,qPCR、WB实验检测三条siHIF-1α对HIF-1α的干扰效率,选出最佳siHIF-1α用于后续实验。实验分为200μg/ml BSA+siNC、200μg/ml BSA-AGE+siNC和200μg/ml BSA-AGE+siHIF-1α三组处理RAW264.7 48小时后,ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10分泌情况;qPCR检测iNOS、Arg1和PDK4的mRNA表达;WB检测iNOS、Arg1和PDK4的蛋白表达。5.siPDK4与AGE-BSA诱导的巨噬细胞极化设计、合成三条PDK4特异的小干扰RNA（siPDK4）,将siPDK4以及siNC转染RAW264.7细胞并验证siPDK4的干扰效率,选出最佳siPDK4用于后续实验。实验分为200μg/ml BSA+siNC、200μg/ml BSA-AGE+siNC和200μg/ml BSA-AGE+siPDK4三组处理RAW264.7,48小时后,ELISA法检测TNF-α、IL-6和IL-10分泌情况;qPCR检测iNOS和Arg1的mRNA表达;WB检测iNOS和Arg1蛋白表达。6.siHIF-1α对PDK4以及siPDK4对HIF-1α表达的影响将siHIF-1α以及对照siNC转染RAW264.7细胞,qPCR和WB实验检测siHIF-1α对PDK4表达的影响。同样,将siPDK4以及siNC转染RAW264.7细胞,qPCR和WB检测siPDK4对HIF-1α表达的影响。7.染色质免疫共沉淀（ChIP）实验检测HIF-1α与PDK4启动子区域的结合构建HIF-1α过表达质粒并验证HIF-1α过表达效率。然后将HIF-1α过表达质粒及其对照质粒转染RAW264.7细胞,实施ChIP实验。UCSC网站预测PDK4的启动子,设计针对PDK4的启动子引物。最后通过qPCR实验检测HIF-1α与PDK4启动子区域的结合情况。8.荧光素酶报告基因实验检测HIF-1α对PDK4表达的调控将PDK4的启动子构建进荧光素酶报告质粒pGL3-luciferase basic中,并将其分别与HIF-1α过表达质粒及其对照质粒转染RAW264.7细胞中,检测荧光素酶强度。9.沉默HIF-1α同时过表达PDK4对AGE-BSA诱导的巨噬细胞极化的影响构建PDK4过表达质粒并验证PDK4过表达效率。然后按以下分组分别处理细胞:BSA+siNC+pcDNA;AGE-BSA+siNC+pcDNA;AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA;AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA-PDK4。ELISA实验检测细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的分泌;qPCR和WB实验检测iNOS和Arg1的mRNA和蛋白表达。10.ROS与AGE-BSA诱导的巨噬细胞极化实验分空白对照、200μg/ml BSA和200μg/ml BSA-AGE三组处理RAW264.7,使用ROS探针检测细胞内ROS水平;ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）处理AGE-BSA诱导的RAW264.7,ELISA检测相应的炎症因子;qPCR和WB实验检测iNOS、Arg1、HIF-1α和PDK4的mRNA和蛋白表达。11.AP-1与AGE-BSA诱导的巨噬细胞极化按照空白对照、BSA和BSA-AGE三组干预RAW264.7,qPCR检测AP-1、Nur77、IRF5/8、NF-κB的mRNA表达;siHIF-1α和siPDK4处理RAW264.7,qPCR检测AP-1 mRNA表达;分别使用NAC、siHIF-1α和siPDK4处理AGE-BSA干预的RAW264.7,qPCR检测AP-1mRNA表达;按以下分组分别处理细胞:BSA+siNC+pcDNA;AGE-BSA+siNC+pcDNA;AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA;AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA-PDK4,qPCR检测AP-1 mRNA表达。研究结果:1.BSA组及AGE-BSA组孵育液避光孵育3个月后,可见AGE-BSA组孵育产物较BSA组明显加深,呈棕黄色。利用高效液相色谱检测仪（high performance liquid chromatography detector,HPLC）构建的流动注射分析系统,设定荧光检测器激发波长370 nm、发射波长440 nm测定糖基化终产物-肽（AGE-P）含量,结果显示AGE-BSA组峰高明显高于BSA组,提示葡萄糖-BSA孵育产物为AGE-BSA。BCA法测得AGE-BSA的蛋白浓度为25mg/ml。2.在apoE^-/-小鼠中构建颈动脉粥样硬化模型,HE染色结果显示,非糖尿病组和糖尿病组左侧颈总动脉均有动脉粥样硬化斑块形成,并且在糖尿病组中,颈总动脉直径的减少比非糖尿病组更明显。AGEs检测试剂盒发现糖尿病组小鼠血浆AGEs显著高于非糖尿病组。ELISA试剂盒检测各模型组小鼠血浆中的细胞因子水平,结果表明糖尿病组小鼠血浆中TNF-α、IL-6表达上调,IL-10表达下调。qPCR和WB实验结果表明糖尿病小鼠动脉粥样硬化斑块中iNOS表达上调而Arg1的表达下调。3.不同浓度梯度（50,100,200和400μg/mL）以及时间梯度（0,12,24,48和72小时）的AGE-BSA处理RAW264.7细胞,结果显示:与对照组相比,随着浓度以及时间的增加,AGE-BSA能够显著增加TNF-α、IL-6分泌,减少IL-10分泌;qPCR和WB实验结果表明,不同浓度梯度以及时间梯度的AGE-BSA增加RAW264.7细胞中iNOS的表达,抑制Arg1的表达。4.qPCR和WB结果表明不同浓度梯度（50,100,200和400μg/mL）以及时间梯度（0,12,24,48和72小时）的AGE-BSA处理RAW264.7细胞后,HIF-1α的mRNA以及蛋白量都显著增加。三条siHIF-1α均可有效抑制RAW264.7细胞HIF-1α表达,其中siHIF-1α-3被选用在后续实验中。200μg/ml BSA+siNC、200μg/ml BSA-AGE+siNC和200μg/ml BSA-AGE+siHIF-1α处理RAW264.7 48小时后,ELISA结果显示沉默HIF-1α抑制AGE-BSA引起的TNF-α、IL-6增加和IL-10减少。qPCR和WB结果表明,沉默HIF-1α能够逆转AGE-BSA引起的iNOS的增加以及Arg1的降低。5.qPCR、WB结果表明不同浓度梯度（50,100,200和400μg/mL）以及时间梯度（0,12,24,48和72小时）的AGE-BSA处理RAW264.7细胞后,PDK4 mRNA和蛋白表达均增加。三条siPDK4均可有效抑制RAW264.7细胞中PDK4的表达,siPDK4-3被用于后续实验。200μg/ml BSA+siNC、200μg/ml BSA-AGE+siNC和200μg/ml BSA-AGE+siPDK4处理RAW264.7 48小时后,ELISA结果表明沉默PDK4抑制AGE-BSA引起的TNF-α、IL-6增加和IL-10减少;qPCR和WB结果表明,沉默PDK4抑制AGE-BSA引起的iNOS增加以及Arg1降低。6.qPCR和WB结果表明,抑制HIF-1α的表达降低RAW264.7中PDK4 mRNA和蛋白的表达量,且差异有统计学意义;抑制PDK4的表达对RAW264.7中HIF-1α的mRNA和蛋白表达无显著影响。7.成功构建HIF-1α过表达系统;染色质免疫共沉淀（ChIP）实验表示过表达HIF-1α后,PDK4的启动子的丰度显著升高。荧光素酶报告基因结果表示过表达HIF-1α能够促进PDK4的启动子启动的荧光素酶表达。8.按照200μg/ml BSA+siNC、200μg/ml BSA-AGE+siNC和200μg/ml BSA-AGE+siHIF-1α三组处理RAW264.7 48 h,qPCR和WB结果显示siHIF-1α能够抑制AGE-BSA诱导的PDK4上调。成功构建PDK4过表达系统。BSA+siNC+pcDNA;AGE-BSA+siNC+pcDNA;AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA;AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA-PDK4处理RAW264.7细胞,ELISA结果表明,与AGE-BSA+siNC+pcDNA相比,AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA组TNF-α、IL-6分泌减少和IL-10分泌增加,而过表达PDK4可以逆转siHIF-1α引起的细胞因子分泌改变。qPCR和WB结果表明HIF-1α抑制引起的iNOS表达减少和Arg1的增加可被PDK4过表达所逆转。9.ROS检测结果表明AGE-BSA使RAW264.7细胞产生ROS增加。ELISA、qPCR和WB的结果提示ROS抑制剂NAC可以抑制AGE-BSA诱导的TNF-α、IL-6增加和IL-10的减少,抑制iNOS的上调和Arg1的下调,并且抑制HIF-1α和PDK4的增加。10.qPCR结果表明,与BSA对照组相比,AGE-BSA处理巨噬细胞后AP-1、IRF5、IRF8和NF-κB的mRNA表达增加,Nur77的mRNA表达减少。其中,AP-1和IRF5 mRNA的增加具有统计学意义,其余转录因子mRNA的改变无统计学意义,且AP-1的上调最为显著。siHIF-1α和siPDK4分别处理RAW264.7,qPCR结果显示AP-1 mRNA表达减低;抑制ROS、HIF-1α或者PDK4能够降低AGE-BSA引起的AP-1 mRNA表达上调。BSA+siNC+pcDNA;AGE-BSA+siNC+pcDNA;AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA;AGE-BSA+siHIF-1α+pcDNA-PDK4处理巨噬细胞,qPCR结果显示siHIF-1α对AGE-BSA引起的AP-1上调的抑制作用可被PDK4过表达所逆转。结论本研究观察到在糖尿病颈动脉粥样硬化小鼠血浆中AGEs水平升高,同时颈动脉粥样硬化较非糖尿病小鼠严重,伴M1型巨噬细胞标记物表达增加,提示糖尿病动脉粥样硬化组织中巨噬细胞向M1型极化增加。体外研究表明AGE-BSA通过促进ROS产生,增加HIF-1α表达,HIF-1α与PDK4启动子区直接结合促进PDK4表达,进而诱导巨噬细胞向M1型极化,即AGE-BSA通过ROS/HIF-1α/PDK4通路促进巨噬细胞M1极化。初步研究提示AP-1可能是PDK4参与AGE-BSA诱导的巨噬细胞极化的下游转录因子。