盐胁迫下盐穗木转录组分析及功能基因的鉴定

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土壤盐渍化不仅是导致生态环境恶化的主要原因之一,也是影响世界范围内农作物生产的主要非生物胁迫因素之一。高浓度的盐会对植物产生次级伤害如渗透胁迫、氧化胁迫和离子毒害等,严重影响农作物的产量和品质。新疆作为中国最大的盐碱土分布区域,土壤盐渍化面积高达11万平方千米,占新疆总面积的7%,但在新疆荒漠盐碱环境中却生长着种类繁多的盐生植物。因此,深入研究新疆荒漠盐生植物耐盐的分子机制,筛选和挖掘耐盐功能基因,有助于利用基因工程技术改良植物的耐盐性,培育耐盐能力强的农作物新品种,开发和利用盐碱地。但由于对植物耐盐分子机制了解甚少,同时缺乏有效的耐盐基因,极大地影响了植物耐盐基因工程技术的应用和发展。盐穗木(Halostachys caspica)隶属藜科盐穗木属,广泛分布在荒漠盐碱地区,绿色期长,生态价值重要。在长期高盐逆境中,盐穗木进化出抵御盐胁迫的独特抗逆特性。利用高通量测序技术,对盐胁迫下盐穗木的转录组进行测序,是研究盐穗木响应盐胁迫差异基因表达的较好途径。本论文以盐生植物盐穗木作为研究材料,围绕高盐胁迫下盐穗木的转录组展开分析。针对盐穗木极强的耐盐特性,研究盐穗木的耐盐机制并挖掘关键耐盐基因进行功能分析。(1)对实验室条件下培养5个月左右的盐穗木苗用500mmol/L NaCl胁迫处理(0 h、3 h及15 d),采同化枝提取RNA后进行高通量转录组测序。通过对3个处理组的盐穗木样品进行测序,获得了大量盐穗木的转录本信息,每个样品文库均大于7G,总测序长度达68,812,002个碱基。共组装了88,574条unigene,N50为997 bp,平均长度为776.89 bp。通过对不同处理组之间的转录组比较分析发现,盐胁迫诱导了盐穗木大量的转录本发生改变。在已注释的基因中,与亲缘关系最近的甜菜(Beta vulgaris subsp.vulgaris)同源性达77.34%。差异表达基因的KEGG分析显示,无论是在短期胁迫还是长期胁迫,差异表达基因在植物激素信号转导(ko04075)、苯丙素的生物合成(ko00940)以及植物-MAPK信号通路(ko04016)等7个通路中显著富集。最后用qRT-PCR技术对转录组结果进行验证,结果显示转录组测序结果是准确可靠的。(2)在3 h短期盐胁迫下,与对照组相比发现甜菜碱、可溶性糖和POD活性显著上调,而Pro下调,但在长期盐胁迫下,活性氧清除相关的POD以及渗透调节相关的甜菜碱和可溶性糖都显著上调,而Pro略有上调,可能在长期盐胁迫下,盐穗木活性氧成分积累,渗透胁迫增加,因此,其体内就需要合成大量活性氧清除酶和渗透调节相关物质来抵御盐胁迫。(3)盐穗木未知功能多肽HcUKPP的原核表达和胁迫耐受性分析。根据前期克隆获得的盐穗木HcUKPP基因,检测了其在盐胁迫3 h和15 d的表达规律,表明HcUKPP受盐胁迫诱导。为了进一步研究盐穗木HcUKPP的耐盐性,本研究构建了原核表达载体pET30a-HcUKPP,检测了不同非生物胁迫下重组大肠杆菌的生长曲线。结果显示,E.coli BL21::pET30a-HcUKPP重组菌在不同浓度NaCl(100~900 mmol/L)、聚乙二醇6000(2.5%~20%,PEG 6000)和甲基紫精(25~200μmol/L)胁迫处理下,其生长均具有明显优势。尤其是在500 mmol/L NaCl、10%PEG 6000和75μmol/L甲基紫精胁迫12 h后,重组大肠杆菌BL21呈现出极显著的优势,分别达到了对照菌的1.81、1.47和3.48倍。进一步构建了pCAMBIA1301-HcUKPP植物表达载体,转化农杆菌并浸染了野生型拟南芥,为在植物中验证HcUKPP的功能奠定了基础。
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