内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类具有游走特性的能定向增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞。1997年，Asahara首次从人外周血单核细胞分离出CD34+和血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)均为阳性的单核细胞，其在体外培养呈梭形，可形成管腔样结构，能够表达内皮细胞的特异性抗原，故命名为EPCs。EPCs主要位于骨髓之中，在机体出现缺血、组织损伤或受到细胞因子、药物等刺激的情况下，可从骨髓向靶部位动员、归巢、分化，形成新生血管，参与血管再生及损伤血管的再内皮化。　　 PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中，是调节各种细胞生长、代谢、分化的重要信号通路。Akt是PI3K下游最主要的作用靶标，PI3K激活导致Akt活化。Akt在PDK-1的作用下完成Ser473和Thr308磷酸化。这样完全活化的Akt从细胞膜上释放下来继续细胞内信号转导的级联反应，参与多种细胞活动、物质代谢调节。有研究显示，PI3K基因敲除鼠的Akt磷酸化降低，单侧肢体缺血后的新生血管形成减少，EPCs整合入内皮网络及迁移的能力减低。　　 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是众多心脑血管疾病共同的病理基础，也是心血管系统疾病中最常见的疾病，严重危害人类健康。内皮细胞的功能障碍是动脉硬化性疾病的标志，损伤的内皮细胞修复或再生可以通过周围成熟内皮细胞的增殖与迁移来完成。但成熟的内皮细胞是一种终末分化细胞，其修复和替代受损内皮细胞的能力相对有限。因此，EPCs作为一种具有分化为成熟内皮细胞潜能的多能干细胞，在血管修复中起着重要作用。　　 普罗布考(Probucol)和西洛他唑(Cilotazol)作为目前较好的抗AS药物，其新的作用机制及应用正在被进一步认识。普罗布考于1977年首先在美国上市，最初以降脂药应用于临床。近几年随着研究的不断进展发现其具有抗氧化、预防或延缓AS的发生和发展、改善内皮功能，同时还具有防治心血管疾病、保护肝脏等多种作用。西洛他唑是一种选择性磷酸二酯酶Ⅲ(PDEⅢ)抑制剂，可抑制血小板及平滑肌内磷酸二酯酶的水解，使cAMP在血小板和血管内的含量上升，抑制了血小板聚集和扩张血管作用，防止血栓形成和血管闭塞，临床现广泛用于慢性动脉闭塞症的治疗，在抗动脉粥样硬化防治血管形成术后再狭窄等方面引起人们的广泛关注。随着进一步的临床实验研究证实，西洛他唑还具有其他安全有效的心血管治疗作用。　　 本研究的主要目的是探讨普罗布考和西洛他唑对内皮祖细胞PI3K/Akt信号通路的影响。阐明普罗布考和西洛他唑影响下的内皮祖细胞介导的血管新生作用的潜在机制，从而为AS等缺血性疾病的治疗和新药的开发提供实验依据。　　 材料与方法　　 一、大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养及鉴定　　 采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离单个核细胞，接种于含有10％胎牛血清的EBM-2MV培养基中，制成细胞悬液，进行培养;收集培养5d的EPCs，免疫荧光法进行细胞特异性标记物CD133、vWF相关抗原检测，鉴定其为内皮祖细胞。　　 二、Real time RT-PCR检测内皮祖细胞中PI3K和Akt mRNA的表达　　 采用实时定量PCR检测不同浓度普罗布考(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)、西洛他唑(0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L)作用后的EPCs中PI3K、Akt mRNA的表达情况。　　 三、Western Blot检测内皮祖细胞中PI3K和Akt蛋白的表达　　 采用Western Blot检测不同浓度普罗布考(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)、西洛他唑(0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L)作用后的EPCs中PI3K/Akt信号通路中PI3K、Akt相关蛋白的表达情况。　　 四、统计学分析　　 各组实验重复三次。应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析和处理，统计方法采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果　　 一、EPCs的培养与鉴定　　 原代培养24h后，细胞大部分呈小圆形;差速贴壁筛选后，培养1d可见少量细胞贴壁;4d后细胞开始伸展成梭形或纺锤形;7d有细胞集落形成，生长旺盛;大约14d融合成内皮细胞单层典型的铺路石样形态。培养第5天CD133、vWF双阳性荧光染色为正在分化的EPCs。　　 二、普罗布考、西洛他唑对EPCs中PI3K/Akt信号通路的影响　　 1、在培养7天的EPCs中加入不同浓度普罗布考(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)、西洛他唑(0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L)，作用24小时后，采用Real time RT-PCR方法检测EPCs中PI3K和Akt的表达情况。结果表明，普罗布考和西洛他唑可以促进EPCs中PI3K和Akt的mRNA的表达。药物作用组与不加药物的对照组比较，P＜0.05。　　 2、在培养7天的EPCs中加入不同浓度普罗布考(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)、西洛他唑(0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L)，作用24小时后，采用Western Blot检测PI3K和Akt蛋白的表达情况。结果表明，普罗布考和西洛他唑可以促进EPCs中PI3K和Akt蛋白的表达。对灰度值的相对比值进行分析表明，药物作用组与不加药物的对照组比较，P＜0.05。　　 结论：　　 1、普罗布考可以促进体外培养大鼠骨髓源性EPCs中PI3K和Akt的mRNA和蛋白的表达。　　 2、西洛他唑可以促进体外培养大鼠骨髓源性EPCs中PI3K和Akt的mRNA和蛋白的表达。