目的缺氧是许多疾病的致病因素,也是临床常见的病理过程。近年研究发现,当吸入气体氧分压或氧浓度下降时,外周血来源的单核细胞(CD45+/CD11b+)在肺部的浸润显著增多,尤其在肺血管周围的聚集最为广泛;同时,肺组织中可以检测到大量炎症介质的合成和分泌。越来越多的研究表明,这些炎细胞和炎症因子是促进缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)发生发展的重要因素。有意思的是,在同样的实验条件下,体循环血管周围没有检测到类似的炎症反应。CADM3(cell adhesion molecular 3)作为一种类免疫球蛋白粘附分子,属于Nectin分子样家族蛋白,主要表达于细胞膜上。以往研究表明,CADM3是神经组织特异表达的细胞粘附分子,对神经元的形成具有重要作用。我们前期实验首次发现,CADM3在缺氧人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中表达增加并参与促进单核细胞粘附。但CADM3是否介导肺循环特异的单核细胞浸润,目前尚未见报道。本课题旨在研究CADM3在缺氧肺血管特异性炎细胞粘附中的作用。方法实验以大鼠肺动脉内皮细胞(rat pulmonary arterial endothelial cell,RPAEC)、大鼠主动脉内皮细胞(rat aortic endothelial cell,RAEC)、人外周血单核细胞系(U937,THP-1)以及外周血白细胞为研究模型,按实验设计分组,U937粘附实验:常氧RPAEC+常氧U937组(CPE+CU),缺氧RPAEC+常氧U937组(HPE+CU),缺氧RPAEC+缺氧U937组(HPE+HU),常氧RAEC+常氧U937组(CAE+CU),缺氧RAEC+常氧U937组(HAE+CU)和缺氧RAEC+缺氧U937组(HAE+HU)(n=3);THP-1粘附实验:常氧RPAEC+常氧THP-1组(CPE+CT),缺氧RPAEC+常氧THP-1(HPE+CT),缺氧RPAEC+缺氧THP-1组(HPE+HT),常氧RAEC+常氧THP-1组(CAE+CT),缺氧RAEC+常氧THP-1组(HAE+CT)和缺氧RAEC+缺氧THP-1组(HAE+HT)(n=3)。缺氧处理(1%O2)组细胞置于三气培养箱连续培养6h,常氧对照(21%O2)组细胞置于普通培养箱培养至相应时间。1.采用流式细胞术检测Di I+细胞比例;荧光定量酶标仪检测细胞裂解液中荧光值;倒置显微镜观察细胞粘附并计数。2.采用免疫印迹法检测CADM3,HIF-1α蛋白表达差异;采用免疫荧光染色观察CADM3和p65蛋白表达及其分布。3.采用抗CADM3抗体封闭和流式细胞检测术,检测Di I+细胞比例。结果1.缺氧对内皮细胞与U937细胞粘附影响:流式检测结果与荧光酶标仪检测结果显示,HPE+CU组Di I+细胞比例以及细胞裂解液中荧光值显著增加,与CPE+CU组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);HPE+HU组与HPE+CU组相比,两组间无差异;RAEC与U937粘附各组间无差异。倒置荧光显微镜观察结果显示,HPE+CU组与CPE+CU组相比,U937细胞粘附率,内皮细胞粘附力均显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05),虽内皮细胞粘附率相应增高,但无统计学差异。HPE+HU组与HPE+CU组相比,各指标差异无显著性意义。2.缺氧促进RPAEC与THP-1细胞、外周血CD11b+白细胞粘附:分别采用流式细胞术与荧光定量酶标仪进行检测。流式结果显示,HPE+CT组与CPE+CT组相比,Di I+细胞比例显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);HPE+HT组与HPE+CT组相比,两组间无差异;RAEC与THP-1粘附实验各组间差异均无显著意义。荧光定量酶标仪结果显示,缺氧RPAEC+外周血白细胞组与常氧RPAEC+外周血白细胞组相比,细胞裂解液中CD11b+荧光强度明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),而其他类型白细胞不具有此特性。另外,RAEC与外周血白细胞粘附实验,各组间细胞裂解液荧光强度无明显差异。3.采用免疫印迹和免疫荧光染色检测CADM3表达水平,缺氧RPAEC组与常氧RPAEC组相比,CADM3表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。常氧RPAEC+LPS组与常氧RPAEC组比较以及缺氧RPAEC+LPS组与缺氧RPAEC组相比,CADM3表达均无明显差异。RAEC各组间CADM3表达无明显差异。4.采用免疫荧光实验观察p65蛋白定位,结果显示,常氧RPAEC组与缺氧RPAEC组中,p65蛋白主要位于细胞胞浆;常氧RPAEC+LPS(5ug/ml)组与缺氧RPAEC+LPS(5ug/ml)组中,p65蛋白主要位于细胞胞核。5.流式细胞术检测抗CADM3抗体封闭对缺氧条件下RPAEC与U937粘附的影响,结果显示,缺氧+抗CADM3抗体组与缺氧组相比,Di I+细胞比例显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.缺氧导致RPAEC与单核细胞/CD11b+细胞的粘附增加,且单核细胞是否缺氧活化对粘附没有影响,表明缺氧特异性活化肺循环来源的RPAEC-单核细胞粘附。2.缺氧特异性诱导RPAEC表达CADM3增加;LPS刺激对CADM3的表达没有影响。3.缺氧诱导的CADM3表达参与RPAEC与单核细胞的特异性粘附。