【摘 要】
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目的:基质胶中包含胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖等成分,其可通过建立一种细胞培养三维环境,来模拟类似体内的三维生长动态。本实验以探索性研究发现为宗旨,把骨髓间充质干细胞包被在基质胶中,利用相差显微镜选取细胞形态和增值状况较良好的时间节点,制作冰冻切片并用苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色观察细胞形态变化,最后采用活/死细胞染色法分析细胞活性,以确定基质胶对
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目的:基质胶中包含胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖等成分,其可通过建立一种细胞培养三维环境,来模拟类似体内的三维生长动态。本实验以探索性研究发现为宗旨,把骨髓间充质干细胞包被在基质胶中,利用相差显微镜选取细胞形态和增值状况较良好的时间节点,制作冰冻切片并用苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色观察细胞形态变化,最后采用活/死细胞染色法分析细胞活性,以确定基质胶对于骨髓间充质干细胞生存、形态、增值的影响。方法:将购买的骨髓间充质干细胞复苏后进行正常培养、传代,选取第3及第4代形态、增值情况优良的细胞与融化的基质胶悬液混合后,铺入24孔板中,待其在恒温培养箱中凝固为凝胶时,添加少量完全培养基继续培养。相差显微镜下观察第1、3、7、14天细胞生长、增值状况,选择时间点为1、3、7天基质胶中的细胞制作冰冻切片,进行HE染色实验进一步观察细胞状态;再选取相同时间节点的细胞用试剂盒进行活/死细胞染色,荧光显微镜下研究判断基质胶三维培养环境下的细胞活性。利用Adobe Photoshop CS4软件编辑相差显微镜观察结果图,NIS-Elements Viewer 4.50修整、裁剪活/死细胞染色图,用Graph Pad Prism 5绘制细胞活性随时间变化的柱形图,整理实验结果,进行统计学分析,采用组间Fisher检验进行不同时间点细胞存活状态的比较与统计,当p值<0.05时表明细胞活性的差异随着时间延长具有统计学差异;当p值<0.01时表明细胞活性的差异随着时间延长具有显著统计学差异。结果:相差显微镜下培养第1天观察,细胞在基质胶中大多形态为短梭形;培养第3天细胞增值数量变多,细胞伸长形态为长梭形;培养第7天细胞继续伸长、相互交织成网;培养第14天基质胶软化塌陷,细胞数量较第7天有所减少。HE染色结果显示,第1、3、7天的细胞,随着培养时间的延长,细胞及胞质逐渐延长,交织、缠绕、连接成网状。活/死细胞染色实验结果表明,在7天培养时间内,培养时间越长,绿色荧光(活细胞)占比越高,分别为90.33%、93.33%、96.61%,这表明基质胶具有良好的生物相容性,不会减弱细胞的增值,细胞包被在其中基本能存活,且能继续生长。结论:骨髓间充质干细胞包裹于基质胶中可使其继续生长增殖,一定时间范围内骨髓间充质干细胞能够伸长、交叉、缠绕成网状,基质胶同细胞结合良好,细胞存活率高、生长状况但随着培养时间继续延长,基质胶会逐渐塌陷崩解,细胞不再增值且数量减少。
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