研究背景多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是一种常见的血液系统恶性疾病,其发病率较高。这种疾病的特点为骨髓中恶性浆细胞克隆性增殖,血液及尿液中可查见单克隆蛋白以及出现相关器官功能障碍。临床表现主要包括溶骨性损伤、贫血、高钙血症、肾功能损伤及反复感染等。尽管近年来对于多发性骨髓瘤的认识及其诊治取得了较快的发展,但其本质上仍是一种不可治愈的疾病,因此,亟待一种更新、更有效的治疗方案。MicroRNAs是一组小的非编码RNA,在转录水平,它通过与靶基因3’UTR端的绑定来负向调节基因的表达。miRNA已被报道在肿瘤的发生及发展过程中发挥重要的作用。作为抑癌基因或者致癌基因,miRNA参与了肿瘤生物学的多个方面,包括细胞的增殖、凋亡、转移及侵犯。正因为在肿瘤中的重要作用,miRNA呈现为一个比较有吸引力的治疗靶点,miRNA将会成功的应用于临床并使临床获益。MicroRNA可以调节多种蛋白的表达进而调节多种生理及病理过程。在多种肿瘤中我们都可以发现异常的miRNA表达,包括多发性骨髓瘤,这表明异常的miRNA表达与肿瘤的发生相关。已有研究发现,miR-186可以作为一种抑癌基因,抑制多种肿瘤的发生,包括肺癌、食管及结直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌等。然而miR-186在多发性骨髓瘤中的表达方式及功能仍然未知。在我们的实验中,我们研究了多发性骨髓瘤中miR-186的表达方式及其特定的功能。研究目的研究miR-186在多发性骨髓瘤细胞系及患者浆细胞中的表达特性,探讨miR-186对多发性骨髓瘤细胞生物学特性的影响,并进一步研究其在多发性骨髓瘤中发挥作用的机制,为深入了解多发性骨髓瘤的发病机制,寻找更新、更有效治疗方案奠定理论基础。研究方法1.患者标本及细胞系：留取30例多发性骨髓瘤患者及18例健康对照者骨髓标本,用CD138磁珠分选其浆细胞。选取并培养多发性骨髓瘤细胞系((MM. 1S, OPM-2, NCI-H929, U266, RPMI-8226)。2.慢病毒制备及质粒转染：扩增miR-186序列,并克隆到HU6-MCS-PGK-EGFP’慢病毒载体,感染293T细胞,获得稳定表达miR-186的病毒颗粒,并进一步转染骨髓瘤细胞系U266和RPMI-8226细胞。用miR-186拮抗剂及拮抗剂阴性对照转染骨髓瘤细胞系H929细胞。细胞系miR-186的表达水平用qRT-PCR证实。3.RNA的抽提及qRT-PCR:应用TRIzol抽提细胞中的全部RNA,进一步合成cDNA,应用实时定量PCR测定miR-186及Jagged1的表达水平。4.质粒的构建及转染：克隆缺少内源性Jaggedl 3’UTR的开放读码框进入pcDN A-Jagged 1表达载体进行miR-186抗细胞增殖效应的营救实验。在荧光素酶实验中,Jaggedl的3’UTR序列被插入到pGL3荧光素酶报告基因中,应用QuikChange定向诱变试剂盒将靶位点进行突变,并根据制造商的说明应用Lipofectamine 2000试剂进行质粒的转染。5.细胞的增殖及平板细胞克隆形成实验：在细胞增殖实验中,应用MTT法在细胞转染24小时、48小时、72小时检测细胞的增殖能力。在克隆形成实验中,将细胞在37℃培养箱中培养2周,然后加入甲醇固定,结晶紫染色,在显微镜底下进行细胞克隆计数。6.细胞周期分析：转染48小时后用胰蛋白酶消化收集细胞,预冷的乙醇固定过夜,碘化丙啶染色。用流式细胞仪检测各组细胞周期。7.裸鼠成瘤实验：将BALB/C裸鼠右侧腋窝皮下注射表达或不表达miR-186的RPMI-8226细胞,观察肿瘤的生长,测量其大小,并计算其体积。细胞注射30天后,摘除肿瘤并应用免疫组化法测定Ki-67,以获取细胞增殖指数。8.荧光素酶报告基因：应用Lipofectamine 2000,将野生型或突变型Jaggedl-3’UTR表达载体与表达miR-186的质粒或空白质粒共转染进入U266或RPMI-8226细胞,利用双荧光素酶报告基因方法测定荧光素酶的活性。9. Western blot实验：应用RIPA裂解液裂解细胞,通过凝胶电泳分离全部蛋白,并转移到PVDF膜。在5%脱脂乳阻断后,将膜加入一抗Jagged1抗体孵育,抗Actin抗体作为对照,在洗膜之前加入过氧化物酶结合的二抗。最终,经增强化学发光试剂处理,在X线胶片上成像。10.统计分析：所有的数据使用均数±标准差进行统计描述,不同组之间比较使用t检验(双侧),应用SPSS13.0软件进行统计学分析,P<0.05视为有统计学意义。为保证实验的重复性,所有的实验均重复3遍。研究结果1.miR-186在多发性骨髓瘤中表达下调：通过实时定量PCR的方法检测多发性骨髓瘤细胞系MM.1S, OPM-2, NCI-H929, U266, RPMI-8226及患者骨髓浆细胞miR-186的表达,并与健康对照组骨髓来源浆细胞相对比。结果显示,在所有检测的骨髓瘤细胞系中,miR-186的表达均下降,其中U266、RPMI-8226表达最低；与这些结果相一致,骨髓瘤患者浆细胞表达miR-186亦下调。实验结果支持,在多发性骨髓瘤中,miR-186为一种潜在肿瘤抑制基因。2.miR-186抑制骨髓瘤细胞增殖,并使细胞周期停滞在G0/G1期：为探究miR-186对骨髓瘤细胞增殖的影响,我们利用miR-186重组慢病毒转染U266、 RPMI-8226细胞系,然后通过qRT-PCR证实miR-186在这些细胞中过表达。MTT实验数据表明,与对照组相比,过表达miR-186的U266、RPMI-8226细胞的增殖显著下降；平板细胞克隆形成实验结果显示,过表达miR-186显著抑制U266、RPMI-8226细胞克隆的形成。我们进一步应用流式细胞技术检测miR-186对细胞周期的影响,与对照组相比,miR-186过表达导致G0/G1期的细胞比例显著增加,S期细胞比例减少,使细胞周期停滞在G0/G1期。与之相反,在H929细胞系中,应用miR-186的拮抗剂来抑制miR-186的表达可以显著提升细胞的增殖及增加S期细胞的比例。这些结果共同提示miR-186抑制骨髓瘤细胞的增殖归因于G0/G1期细胞周期的阻滞。3.miR-186抑制裸鼠骨髓瘤移植物的生长：为进一步验证miR-186是否对体内肿瘤的生长有抑制作用,我们分别将稳定表达miR-186或阴性对照的RPMI-8226细胞皮下注射到裸鼠右侧腋下。与阴性对照组相比,稳定表达miR-186的RPMI-8226细胞种植小鼠肿瘤生长速度缓慢；种植后30天,稳定表达miR-186组肿瘤重量最小；另外,免疫组化显示Ki-67阳性细胞在miR-186表达组中显著降低。4.miR-186调控Jagged1的表达：为进一步探究miR-186介导骨髓瘤细胞增殖的分子机制,我们通过TargetScan寻找miR-186可能的靶基因,在这些被鉴别的靶基因中,考虑到对骨髓瘤细胞增殖及生存的影响,Jagged1被选择为miR-186的候选靶基因。为确定Jagged1是否为miR-186的直接下游靶点,我们克隆Jagged1的3’UTR序列进入pGL3荧光素酶报告基因载体,U266、RPMI-8226细胞与野生型或突变型3’UTR载体及表达miR-186的质粒共转染。与对照组相比,过表达miR-186使转染野生型Jagged1-3’UTR的荧光素酶活性显著下降,而对突变型3’UTR的荧光素酶活性无影响；qRT-PCR结果显示,过表达miR-186对Jagged1 mRNA水平无影响,而western blot结果显示,与正常对照组相比,转染miR-186的U266、RPMI-8226细胞Jagged1蛋白水平显著下降。转染miR-186拮抗剂的H929细胞Jagged1蛋白水平显著上升。基于这些研究结果,我们推断miR-186通过靶向Jagged1-3’UTR来调节其蛋白的表达。5. Jagged1过表达可以逆转miR-186的作用：为进一步说明Jagged1是否为miR-186的功能靶点,我们将敲除3’UTR的Jagged1质粒转染进入miR-186表达的RPMI-8226细胞,进行功能获得性分析。免疫印记法结果显示,与RPMI-8226或RPMI-8226/miR-186相比,转染敲除Jagged1-3’UTR质粒的细胞表达Jagged1水平显著增高。过表达Jagged1可以显著逆转miR-186所致的细胞生长抑制、平板集落形成的减少以及对细胞周期的阻滞。这些数据表明miR-186通过抑制Jagged1的表达来抑制细胞的增殖。研究结论1.多发性骨髓瘤患者浆细胞及骨髓瘤细胞系miR-186的表达下降。miR-186抑制细胞的增殖、平板细胞克隆的形成,使骨髓瘤细胞停滞在细胞周期的G0/G1期,并抑制裸鼠骨髓瘤移植物的生长。这些结果强烈支持,在多发性骨髓瘤中,miR-186起到肿瘤抑制作用。2.miR-186可能通过靶向抑制Jagged1在多发性骨髓瘤细胞中的表达水平,从而参与调控多发性骨髓瘤细胞的增殖。