研究背景:食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,全世界每年有大量患者因其而死亡。目前,其治疗的主要方式依然是手术治疗。而对于不可切除食管癌患者治疗方法是以放疗和化疗等为主的综合治疗,但总体效果不满意。其他局部治疗多采取消融技术来缓解症状,抑或减小肿瘤以达到可再次手术的目的,如射频消融、冷冻消融及微波消融。然而,这些方法主要是以热效应发挥作用,对组织缺乏选择性。不可逆电穿孔（irreversible electroporation,IRE）技术又称纳米刀,是一种能有效消融肿瘤的新技术。IRE主要是通过释放高压直流电,利用电极传递电脉冲,产生强力的电场,改变细胞跨膜电位,使磷脂双分子层重排,从而在细胞膜上产生永久性的纳米孔,影响细胞稳态,导致细胞凋亡。与常见的消融术相比,IRE依赖瞬间的高压电场而不是热效应来发挥作用,因此其不受大血管血流的热沉作用影响,且组织选择性较好,能保存被消融区的重要结构,如神经、大血管等。IRE在实质性肿瘤如肝癌、胰腺癌、肾肿瘤及前列腺癌等治疗应用中已经有了广泛的研究,而对食管癌这种空腔脏器方面研究较少。虽然IRE对众多肿瘤有着良好的效果,但由于IRE电场分布不同,电极中心的场强高,而周围较低,这就导致对于较大的肿瘤组织,其边缘难以消融完全。因此,近年来,对于联合IRE和其他治疗方法的研究也越来越多。有研究报道将IRE和化疗药物共同应用于胰腺癌及肝癌的治疗当中,比单用IRE或单用化疗药物的效果要好很多。而IRE联合化疗药物对食管癌是否产生更好的作用还不得而知。目的:验证IRE对食管组织消融的作用及安全性;评估IRE对食管癌细胞的杀伤作用,并观察不同参数的效果;探索IRE消融食管癌细胞的具体机制;验证IRE联合化疗药物5-Fu对食管癌的治疗作用,并初步探索其机制。方法:1.应用平板电极对新西兰大白兔腹段食管进行IRE处理,然后取材,石蜡切片,进行HE染色和Masson染色,显微镜下观察食管组织的病理学变化。2.应用MTT法检测不同电场强度下,IRE对食管癌细胞EC109和KYSE30细胞存活率的影响;光学显微镜下观察IRE处理后的细胞变化;western blot及Annexin V-FITC/PI检测细胞的凋亡情况;结晶紫染色法评估IRE对食管癌细胞增值的影响;建立食管癌细胞EC109裸鼠皮下移植瘤,体内检测IRE对食管癌的作用。3.线粒体染色后,激光共聚焦显微镜观察IRE处理后食管癌细胞线粒体的形态变化;流式细胞学检测线粒体膜电位和ROS的生成;western blot检测IRE对线粒体细胞色素c及线粒体稳态相关蛋白OPA1、TFAM和NRF2的影响。4.应用MTT法和Annexin V-FITC/PI检测IRE联合5-Fu对食管癌细胞的作用;建立食管癌细胞EC109裸鼠皮下移植瘤,体内检测IRE联合5-Fu的治疗作用,同时应用HE染色观察其对其他脏器的副作用。5.应用western blot和免疫荧光法检测单独5-Fu处理、单独IRE处理以及IRE和5-Fu联合应用后食管癌细胞LC3、p62蛋白的表达情况。结果:1.经IRE处理后,实验兔食管组织内实质细胞大量死亡,而胶原纤维保存完好,且与对照组相比,IRE没有导致食管瘘等不良事件的发生。2.IRE处理可降低食管癌细胞EC109和KYSE30的存活率,且程度与电场强度成正比;IRE处理后食管癌细胞形态改变,甚至有碎片产生;IRE处理导致食管癌细胞的凋亡,抑制其增殖。3.IRE处理后,食管癌细胞的线粒体形态发生改变,直径和周长变短,且线粒体膜电位下降,而ROS生成增加,表明线粒体损伤的发生;IRE处理后,线粒体细胞色素c释放增加,而线粒体稳态相关蛋白OPA1、TFAM和NRF2的表达均下降。4.IRE联合5-Fu应用后食管癌细胞EC109、KYSE30凋亡明显增加;体内结果显示IRE联合5-Fu应用使裸鼠肿瘤体积减小、重量减轻,且对其他脏器组织无不良影响。5.5-Fu处理食管细胞EC109和KYSE30后,LC3表达升高,而p62表达下降,诱导产生保护性的自噬;而IRE可减弱5-Fu诱导的食管癌细胞自噬水平。结论:本章节实验结果证明IRE应用于兔食管组织是安全有效的,其对食管癌细胞具有杀伤作用,可能是其影响线粒体的稳态,导致线粒体损伤,从而促使食管癌细胞凋亡;而且联合IRE和化疗药物5-Fu能够发挥更好的治疗效果,这可能与IRE减弱食管癌细胞的自噬相关。