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神经退行性疾病和神经元损伤是神经系统常见病。此类疾病的预后与神经细胞的存活、神经元分化和功能恢复密切相关,亦与相关基因表达的激活或抑制有关。拓扑异构酶Ⅱβ(TopoisomeraseⅡβ,TopoⅡβ)是促进神经发育和神经元分化的关键蛋白质。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是从伞形科藁本属植物川芎中分离提纯的一种活性生物碱,化学名2,3,5,6-四甲基吡嗪。最近有研究报道了其对神经干细胞向神经元分化有促进作用,但其确切作用机制尚不明了。本研究以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元分化模型,用TMP诱导其向神经元分化,并检测细胞分化过程中TopoⅡβ的表达变化;进而探讨TMP诱导神经元分化的分子机制。为TMP在神经系统疾病相关研究与治疗中的应用提供依据。本研究共分三部分。第一部分川芎嗪对SH-SY5Y细胞生长特性的影响和神经元分化的诱导作用目的:研究TMP对SH-SY5Y细胞生长状况的影响,以及诱导其向神经元分化的作用。方法:1、细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基,置饱和湿度和37℃于5%CO2培养箱内培养。2、MTT法检测SH-SY5Y细胞体外增殖活性,绘制细胞生长曲线。3、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验:不同浓度的TMP处理1~5天,测定LDH释放百分率评价TMP的细胞毒性。4、细胞周期和凋亡率检测:分别在TMP作用0,3和5天收集细胞,流式细胞术分析G0/G1、S和G2/M期细胞百分比,并检测凋亡率。5、细胞核DAPI染色:分别在TMP作用0,1,3和5日进行DAPI染色,观察细胞核形态。6、Caspase-3活性检测:SH-SY5Y细胞以80μmol/L TMP作用0,1,3和5天后收集细胞,检测样品Caspase-3的活性。7、细胞分化形态观察和分化百分率检测:不同浓度的TMP诱导分化,分别在0~5天观察、测量各组细胞突起长度的变化。以单个细胞总突起长度大于100μm作为细胞分化标准,计算细胞分化百分率。8、免疫印迹(Western blot)检测神经元分化标志蛋白MAP2、tau的表达和p21蛋白的表达。9、统计学方法:实验结果以x±s表示,单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为有显著性意义。结果： 1 MTT检测TMP对SH-SY5Y细胞体外增殖的影响在各个时间点,20μmol/L TMP对SH-SY5Y细胞增殖无明显影响(P>0.05)。细胞分别在40,80,120,160,320和400μmol/L TMP作用下,增殖受到抑制(P<0.05)。随着TMP浓度的增高和培养时间的延长,其对细胞增殖的抑制逐渐增加。提示TMP对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性。2 LDH释放实验检测TMP的细胞毒性40,80和120μmol/L TMP分别处理SH-SY5Y细胞。在1、3和5天检测LDH释放百分率,与对照细胞比较,均显示无明显差异(P>0.05)。160μmol/L TMP作用5天LDH释放比率分别为16.1±1.50%,和对照组11.2±1.20%相比有统计学差异(P<0.05)。240μmol/L TMP作用1、3和5天,LDH释放比率分别为14.5±2.00%,16.6±2.00%,19.5±3.32%,对照组分别为11.7±1.34%,11.1±1.56,11.2±1.20%,有明显的统计学差异(P<0.05)。上述结果表明,低浓度TMP(40,80和120μmol/L)对SH-SY5Y细胞无明显细胞毒性。3 TMP对细胞周期分布和凋亡的影响SH-SY5Y细胞在80μmol/L处理0、3和5天,与对照组细胞相比较G0/G1期细胞增多,表明发生G0/G1期阻滞(P<0.05)。与对照细胞向比,TMP可引起细胞周期抑制因子(G0/G1抑制蛋白)p21蛋白的表达升高(P<0.05)。80μmol/L TMP处理细胞在0,1,3和5天,检测2倍体峰前均未发现明显凋亡峰;DAPI染色观察细胞核形态,细胞核表现形态完整,均未见凋亡小体等凋亡特征性改变。TMP处理后,Caspase-3活性和active-Caspase-3蛋白表达无明显变化(P>0.05)。显示80μmol/L TMP在诱导SH-SY5Y细胞神经元分化中未导致细胞凋亡。4细胞分化形态学变化和分化百分率TMP诱导组细胞出现增殖速度下降,细胞逐渐伸出突起;且突起的数量和长度明显增加。对单个细胞平均神经突起长度测量,结果显示:在20μmol/L TMP作用下,SH-SY5Y细胞突起长度和分化百分率改变不明显(P>0.05)。而40μmol/L诱导2天,细胞突起开始出现明显增长,与对照细胞比较有显著性差异(P<0.05)。80μmol/L和120μmol/L TMP诱导SH-SY5Y细胞后,细胞神经突起长度和分化百分率均较对照细胞明显增长,且均比40μmol/L诱导后突起长度增加明显(P<0.05)。5神经元分化的鉴定采用神经元分化标志分子,微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)和tau蛋白鉴定神经元分化。SH-SY5Y细胞经80μmol/L TMP诱导0,3和5日后MAP2和tau蛋白表达增高,与对照组细胞相比有明显差异(P<0.05)。结论:80μmol/L TMP诱导可使SH-SY5Y细胞脱离细胞周期,并向神经元分化;且未见明显的细胞毒性。因此,本研究选用80μmol/L TMP诱导神经元分化,并继续用于后继机制研究。第二部分川芎嗪上调TopoⅡβ诱导SH-SY5Y细胞分化的表观遗传学机制目的:检测TMP诱导SH-SY5Y细胞分化过程中,TopoⅡβ的表达变化及其表观遗传学机制。方法:1、细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基,置饱和湿度和37℃于5%CO2培养箱内培养。2、细胞分化形态观察和分化百分率检测:用80μmol/L TMP诱导分化,分别在0~5天观察和测量细胞平均突起长度,以单个细胞突起总长度大于100μm作为细胞分化标准,计算细胞分化百分率。3、Western blot检测TopoⅡα、TopoⅡβ、组蛋白H3、H4、乙酰化组蛋白H3(acetylated histone H3,Ac-H3)和乙酰化组蛋白H4(acetylated histone H4,Ac-H4)的表达。4、逆转录PCR(RT-PCR)检测TopoⅡβm RNA表达。5、染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)检测Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因启动子区的募集与结合。6、统计学方法:同第一部分。结果:1 Western blot检测TopoⅡβ和TopoⅡα蛋白的表达与对照细胞比较,TMP诱导分化细胞的TopoⅡα蛋白表达在第3天和第5天均明显减少(P<0.05);而TopoⅡβ蛋白表达则明显增加(P<0.05)。2 RT-PCR检测TopoⅡβmRNA表达与对照细胞相比,TopoⅡβm RNA的表达在TMP诱导分化的第3天和第5天均表现为增加(P<0.05)。3 ICRF-193拮抗TMP诱导TopoⅡβ表达和神经元分化TopoⅡβ抑制剂ICRF-193作用后,TopoⅡβ和MAP2蛋白表达受到抑制(P<0.05);神经突起数量和长度均明显下降(P<0.05)。表明TopoⅡβ与神经元分化呈正相关。4 TMP诱导组蛋白H3和H4出现过乙酰化Ac-H3的表达在TMP诱导分化的第3天和第5天逐渐增加(P<0.05);而Ac-H4的表达在TMP诱导分化的第5天明显增加(P<0.05)。提示Ac-H3与Ac-H4均可被TMP诱导表达,而Ac-H3表达升高相对较早。5 TMP增强Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因启动子区的结合着诱导分化时间的延长,特异性结合在TopoⅡβ基因启动子区的Ac-H3与Ac-H4逐渐增高(P<0.05)。Ac-H3在TopoⅡβ基因启动子区的结合早于Ac-H4。提示Ac-H3发挥作用早于Ac-H4。结论:TMP诱导神经元分化作用与TopoⅡβ表达的上调有关。TMP促进Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因启动子区的募集而诱导TopoⅡβ高表达,是促进神经元分化的重要机制。第三部分PI3K/Akt信号通路参与川芎嗪诱导SH-SY5Y细胞神经元分化目的:探讨TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,PI3K/Akt和ERK1/2信号通路对TopoⅡβ表达和神经元分化的影响及机制。方法:1、细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基,置饱和湿度和37℃于5%CO2培养箱内培养。2、细胞分化形态观察和分化百分率检测:用80μmol/L TMP诱导细胞分化。分别在0~5天测量计算细胞平均突起长度,以单个细胞总突起长度大于100μm作为分化标准,计算细胞分化百分率。3、Western blot检测蛋白质表达。4、RT-PCR检测TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表达。5、Ch IP检测转录因子Sp1与NF-YA在TopoⅡβ基因启动子区的结合。6、统计学方法:同第一部分。结果:1 TMP对p-Akt、p-ERK1/2、TopoⅡα、TopoⅡβ、Sp1和NF-YA蛋白表达的影响80μmol/L TMP诱导SH-SY5Y细胞分化0,1,3和5天。TopoⅡα蛋白的表达逐渐减少,TopoⅡβ蛋白表达逐渐增多;p-Akt的表达逐渐升高(P<0.05),p-ERK1/2表达无明显变化(P>0.05);Sp1的表达逐渐增高(P<0.05),而NF-YA蛋白表达无明显变化(P>0.05)。2 PI3K/Akt抑制剂LY294002对p-Akt,TopoⅡα、β、Sp1和NF-YA蛋白表达的影响应用LY294002后,80μmol/L TMP诱导细胞分化5天,TopoⅡα蛋白的表达减少,且不受LY294002的影响;TopoⅡβ和Sp1蛋白表达和p-Akt的表达受到明显抑制(P<0.05)。p-ERK1/2和NF-YA蛋白的表达无明显变化(P>0.05)。3 LY294002抑制TMP诱导的神经突起的发生和神经元分化标志蛋白的表达TMP诱导第5天,应用LY294002后,TMP诱导细胞的突起长度由150.97±6.62μm下降为91.80±7.82μm(P<0.05),细胞分化百分率由80.04±3.26%下降为46.20±33.56%(P<0.05)。而MEK/ERK抑制剂U0126对细胞形态、细胞突起长度和分化百分率均未产生明显作用(P>0.05)。经LY294002处理细胞后,神经元分化标志蛋白MAP2的表达受到明显抑制(P<0.05)。而U0126对MAP2蛋白表达未产生明显抑制作用。表明PI3K/Akt信号通路参与了TMP诱导的SH-SY5Y细胞分化。4 LY294002对TMP诱导TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表达的影响TMP可上调TopoⅡβm RNA的表达,而抑制TopoⅡαm RNA的表达。与TMP诱导组相比较,加入PI3K/Akt抑制剂LY294002作用后,TopoⅡβm RNA的表达下调(P<0.05),而TopoⅡαm RNA的表达无明显改变(P>0.05)。分别应用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(Cycloheximide,CHX)和RNA聚合酶II抑制剂鹅膏菌素(α-amanitin)预处理SH-SY5Y细胞后检测TopoⅡβm RNA的表达,结果显示:α-amanitin(50μg/m L)可明显降低TMP诱导的TopoⅡβm RNA的表达,而CHX(10 mmol/L)则对其表达无明显影响。表明TMP上调TopoⅡβ的表达发生在转录水平,并且与PI3K/Akt信号途径的激活有关。5 TMP诱导转录因子Sp1和NF-YA在TopoⅡβ基因启动子区结合Ch IP检测显示,TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,Sp1蛋白特异性结合在TopoⅡβ基因启动子GC盒,促进了TopoⅡβ的转录表达。而加入PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002作用后,结合在TopoⅡβ基因启动子区的Sp1蛋白受到明显抑制(P<0.05)。转录因子NF-Y的亚型NF-YA在神经分化后期与TopoⅡβ基因启动子区的结合也呈现增高(P<0.05),而LY294002对NF-YA与TopoⅡβ基因启动子区的结合没有明显影响(P>0.05)。结果提示PI3K/Akt/Sp1/TopoⅡβ信号途径参与了TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。结论:TMP诱导神经元分化过程中,PI3K/Akt信号被激活;转录因子Sp1受到PI3K/Akt通路的调控;Sp1与TopoⅡβ基因启动子区结合,促进TopoⅡβ基因的转录激活。PI3K/Akt/Sp1/TopoⅡβ信号途径参与了TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。