多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)指含有两个或两个以上双键且碳链长为16-22个碳原子的直链脂肪酸，比如DHA(docosahextaenoicacid，22:6n-3)，它们对人类健康非常重要，比如:减轻炎症，调节血压，降低胆固醇的含量，调控脂类代谢，预防和治疗动脉粥样硬化和心血管疾病，调节机体的免疫功能，调节中枢神经系统功能，还可以开发为抗肿瘤药物。目前，DHA主要来源于深海鱼油，但是随着市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少，深海鱼油已经远远不能满足需要，因此，寻找更为持续、稳定的PUFAs来源成为当务之急。海洋微藻是DHA的初级生产者，被看做是可被利用的生产PUFAs的另一重要资源。PUFAs生物合成过程中涉及到一系列脂肪酸脱氢酶和延长酶。近年来，对海洋微藻PUFAs合成相关酶基因的研究进展非常快，已经从多个藻种中克隆了参与DHA合成所涉及的脱氢酶和延长酶基因，并且实现了基因的异源表达，这为实现得到高产的PUFAs，解决DHA资源问题，提供了一条新的途径。脂肪酸脱氢酶和延长酶的功能验证具有重要的生化应用意义，这些基因能够被用在富含PUFAs的转基因油料作物上，具有重要生物学作用。在生物体中，合成DHA主要是通过两种途径进行的:△6脱氢途径和△8脱氢途径。本实验通过对在酿酒酵母中DHA的两条合成途径进行研究，为转基因作物生产DHA提供实验依据。本论文实验材料巴夫藻和球等鞭金藻为自养藻，PUFAs含量丰富，可达总脂肪酸的30％以上，是研究脂肪酸合成途径的非常好的实验材料。本研究主要内容包括：　　 ⑴利用LA-PCR方法，从球等鞭金藻中克隆到△4脂肪酸脱氢酶基因，命名为IgFAD4-2。IgFAD4-2全长1302bp，编码433个氨基酸，推测的多肽序列具有典型的脂肪酸脱氢酶保守结构域，包括一个细胞色素b5结合域和三个组氨酸盒子。将IgFAD4-2转化酿酒酵母INVScl中，外源添加底物二十二碳五烯酸(Docosapentenoic acid，DPA)进行发酵培养后分析转化子的脂肪酸组成，结果表明IgFAD4-2基因在酿酒酵母中获得了高效表达，重组菌株对外源底物的转化效率达到了34.2％。　　 ⑵通过LA-PCR方法从巴夫藻中克隆到△5脂肪酸延长酶基因，命名为PvElo5。PvElo5全长840bp，编码279个氨基酸，推测的多肽序列具有△5脂肪酸延长酶典型的组氨酸保守结构域和内质网结合域。将PvElo5转化到酿酒酵母INVSc1中，外源添加底物二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)进行发酵培养后分析转化子的脂肪酸组成，结果表明，PvElo5基因在酿酒酵母中获得了高效表达，重组菌株对EPA转化为DPA的转化率为26.9％，将花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)转化为二十二碳四烯酸(Adrenic acid，ADA)的转化率为26.3％。　　 ⑶利用IgFAD4-2和PvElo5，构建了酿酒酵母△8共表达载体pYAE5-E5-D4和△6共表达载体pYMM5-E5-D4，在添加诱导剂半乳糖和外源底物α-亚麻酸(α-Linolenic aicd，ALA)的情况下，进行诱导表达。工程菌株YAE5-E5-D4和YMM5-E5-D4总脂肪酸甲酯气相色谱分析表明，ALA可以转化为终产物DHA，DHA分别占总脂肪酸的3.1％和1.6％。　　 ⑷利用Real-time PCR和脂肪酸含量的分析，发现在PUFAs合成中，△8途径比△6途径更加有效，另外，为了优化DHA的产量，利用响应面法对底物添加量，诱导时间和诱导温度进行深入探究，确定工程菌YAE5-E5-D4在添加底物为104.2μmol/L，诱导温度为23.4℃，诱导时间为56.7h时，DHA最大产量为20.56mg/L/d; YMM5-E5-D4在添加底物为167.7μmol/L，诱导温度为24.2℃，诱导时间为49.6h时，DHA最大产量为16.58mg/L/d。