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通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达,是植物对其生长发育及生理代谢调控的一种重要方式。DREB转录因子基因家族的成员广泛存在于拟南芥、玉米、番茄、烟草和水稻等各种植物中,并参与调控各种功能基因的表达。本研究对从沙生植物胡杨中新克隆的PeDREB2a和PeDREB2b转录因子基因的基本特性及生物学功能进行了系统的研究,证明这两个基因具有DREB类转录因子基因的基本特性,它们在转基因烟草中的过表达可以提高植物抵抗非生物胁迫的能力。这些研究结果为深入了解这两个基因调控植物胁迫应答反应的分子机理提供了理论基础,也为利用基因工程的方法改良作物的抗逆性提供了优良的候选基因。主要研究结果如下:1.根据植物中DREB基因DNA结合域保守区设计简并引物,以沙生植物胡杨的叶片为材料,RT-PCR扩增出2个DREB基因同源片段;据此设计基因特异引物,通过RACE-PCR分离克隆出2个DREB转录因子基因,PeDREB2a(序列号:EF597499)和PeDREB2b(序列号:EU195881),氨基酸序列比对表明,这2个基因为典型的DREB2转录因子基因。2.半定量RT-PCR对这2个基因在不同胁迫条件下的表达情况进行了检测,结果显示:这两个基因的表达均受干旱、高盐和低温环境逆境的诱导,并且其表达不依赖于ABA的调控。3.以基因组DNA为模板对PeDREB2a和PeDREB2b进行了PCR扩增,扩增产物经序列分析表明,PeDREB2a和PeDREB2b基因均无内含子。4.构建两个酵母效应质粒pBridge-PeDREB2a和pBridge-PeDREB2b,转入酵母菌株AH109中,并分别在缺少色氨酸的SD培养基和缺少色氨酸、组氨酸的SD双缺陷培养基上筛选阳性转化子。酵母表达表明,PeDREB2a和PeDREB2b均具有明显的转录激活功能,β-半乳糖苷酶活性分别为27.8U和23.75U,Whatman滤纸显色反应均能呈现明显的蓝色,初步在酵母体中通过酵母单杂交试验验证这两个转录因子具有转录激活功能。5.构建绿色荧光蛋白融合表达载体,基因枪法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达,结果表明,PeDREB2a和PeDREB2b蛋白均定位于细胞核中,与亚细胞定位预测一致。6.构建植物表达载体pCAMBIA2301-PeDREB2a和pCAMBIA2301-PeDREB2b,利用农杆菌介导法转化烟草NC89;通过Kan抗性、PCR及RT-PCR筛选鉴定阳性苗。对转基因烟草苗进行干旱、高盐等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定,结果显示转基因烟草苗对这些非生物胁迫均有较高的抵抗能力。