目的:1.建立合适的玻璃化冷冻复苏条件;2.探讨玻璃化冷冻对小鼠胚胎发育的影响;3.探讨玻璃化冷冻对胚胎DNA甲基化水平的影响;4.探讨玻璃化冷冻对胚胎印记基因Grb10转录水平及DNA甲基化的影响;方法:实验共分为三组,自然交配的3.5dpc(days post coitus)体内囊胚为对照组;8-细胞胚经玻璃化冷冻复苏处理发育到囊胚和8-细胞胚直接体外培养至囊胚设置为实验组。其中,自然交配的3.5dpc体内囊胚为体内组,体内8-细胞胚体外培养至囊胚为体外组,8-细胞胚经玻璃化冷冻复苏处理发育至囊胚为冷冻组。通过成功的玻璃化冷冻后,分别计算实验组胚胎的囊胚率和和孵化率;通过免疫荧光技术计算各组的5-Me C(5-Methylcytosine)甲基化的荧光强度;通过选择合适的“相对标准品”,进行一系列5倍稀释后建立相对标准曲线,实时荧光定量PCR检测各组印记基因Grb10转录水平的变化;通过亚硫酸氢盐对甲基化胞嘧啶修饰的结果,对修饰产物进行PCR测序和序列对比,检测单个囊胚中印记基因Grb10 CGI1(Cp G island 1)甲基化修饰的变化。结果:玻璃化冷冻结果显示冷冻组的囊胚率和体外组相比无显著差异,冷冻组的囊胚孵化率显著低于体外组;胚胎免疫荧光结果表明冷冻组的5-Me C荧光强度分别低于体外组和体内组。实时荧光定量PCR检测显示冷冻组中印记基因Grb10的转录水平较体内组和体外组下降,体外组的转录水平与体内组无显著差异;微量亚硫酸氢盐修饰后测序显示冷冻组中印记基因Grb10 CGI1甲基化水平明显降低,而体外组的甲基化水平更低。结论:小鼠胚胎玻璃化冷冻可能降低8-细胞的体外发育及冷冻囊胚的DNA甲基化水平,免疫荧光显示冷冻囊胚的DNA全基因组甲基化水平显著低于体内囊胚。玻璃化冷冻影响印记基因Grb10的转录表达,玻璃化冷冻胚和体外发育胚中印记基因Grb10 CGI1区均呈低甲基化状态,说明印记基因的表达除甲基化控制外,还可能有其他调控因素存在。