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木聚糖酶能降解木聚糖生成木寡糖或木糖,在造纸、饲料、食品、能源等领域有极其广泛的应用。本实验室筛选得到的黑曲霉木聚糖酶XynA具有高的催化活力,但不适于高温的工业生产过程。XynA结构呈β-jelly-roll状,由一个α螺旋连接在上下游β折叠片之间。此结构在糖苷水解酶中具有高度保守性。海栖热袍菌葡聚糖酶Glu也呈β-jelly-roll状,有很高的稳定性。将Glu下游β折叠片同位替换Xyn中,得到突变体Xyn_上-αx-Glu_下,期望热稳定性得以提高。本文得到如下结果:(1)探讨新型的基因连接载体的方法:反向PCR。第一步,设计合成引物,进行PCR使所得基因下游与载体有相匹配区域;第二步,以所得基因作为上游引物,加入与模板互补的反向引物,以环状载体为模板,进行反向PCR实现融合基因和载体的连接,线型重组质粒DNA经过T4 DNA连接酶的环化,而后直接转化感受态细胞。以此方法成功构建了重组载体pET20b-Xyn_上-αx-Glu_下,此方法周期短,阳性率高。(2)N端氨基酸密码子优化:重组载体pET20b-Xyn_上-αx-Glu_下转化BL21(DE3)后,胞内表达目的蛋白量极低。为提高目的蛋白的表达量,将N端氨基酸密码子进行优化,结果显示胞内蛋白的表达量显著提高。蛋白检测发现,绝大部分目的蛋白形成非正常折叠的包涵体形式。(3)包涵体的可溶性表达:为去除蛋白的包涵体,探讨了诱导剂浓度、诱导时间的正交实验设计、引入两个RBS等实验,包涵体的情况没有明显改善。进一步,利用载体pET-20b自身的引导肽序列pelB,探讨了Xyn_上-αx-Glu_下胞外分泌结果,得到胞外可溶的目的蛋白,成功的将包涵体去除。在诱导18h后,胞外酶活达到最高6.5U/mL。(4)Xyn_上-αx-Glu_下的性质:胞外表达的重组蛋白Xyn_上-αx-Glu_下最适pH为5.2,相对于野生型Xyn为3.8有明显提高。重组蛋白的最适反应温度为55℃,野生型为48℃左右,突变后最适反应温度明显升高。在55℃条件下,该重组酶的半失活时间为27min较野生型的8min有明显提高。由此可以看出,利用空间结构的同源性和保守性,将高热稳定性葡聚糖酶Glu的下游β折叠片和木聚糖酶同位置结构进行替换,得到的突变体酶Xyn_上-αx-Glu_下较野生型Xyn最适反应温度和55℃下半失活时间均有明显提升,为基于结构的酶分子改造提供了新的思路。