花椒DNA提取方法及条形码鉴定研究

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芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)植物在我国有39种,目前对其区分主要以形态鉴定为主。DNA条形码鉴定是一种新型的物种鉴定方法,是利用基因组中一段相对较短的片段对物种进行鉴定的分子技术。本实验探究对花椒属植物不同材料样本DNA提取方法的优化,使用DNA条形码鉴定方法对花椒属9种植物共121份样本使用ITS2序列进行鉴定研究,旨在使用分子鉴定的手段准确地对花椒属植物进行鉴定,并尝试使用ITS2序列对花椒(Z. Bungeanum)及竹叶花椒(Z. armatum)种内的不同品种进行鉴定。主要研究内容及结果如下:(1)使用在DNA提取中较为常见的两种方法CTAB法及试剂盒法,对本次实验采集的花椒属121份样本进行提取与改良,结果表明,两种方法对新鲜叶片及经过硅胶干燥叶片材料的DNA提取均能获得成功,果皮类材料经过改良提取方法:在加入DNA提取液之前,使用核分离液洗涤3次,水浴时间1h,也能成功提取DNA。两种方法均能获得符合PCR要求的总DNA。PC后电泳检测条带明亮、单一,其样本经测序、序列拼接及注释剪切后共获得121条ITS2序列。(2)使用ITS2片段对花椒属植物进行鉴定,结果表明ITS2序列能够有效鉴定本次实验收集的花椒属9种植物,除花椒Z. Bungeanum以外,8种植物的种内最大K2P距离均小于与其余物种间的种间最小K2P距离,可以明显与其余物种进行区分。各物种在ITS2序列中有稳定区别于其他8个物种的位点,可作为鉴别花椒属9种植物的辅助手段,能将花椒属9种植物进行良好地区分。邻接(NJ)法构建的系统聚类树,各物种均能各自聚为一支,能较好地与其他物种较好地区分开。(3)在使用ITS2序列对花椒及竹叶花椒的品种进行鉴定时,花椒种内4个品种中,汉源花椒、越西贡椒及灵山正路椒ITS2序列一致,无法使用ITS2序列进行鉴定区分,但来自四川松潘、茂县、汶川的花椒样本与甘肃礼县、临夏、天水的花椒样本在3个位点上一致表现出与其余产地花椒样本的差异。竹叶花椒种内3个品种在ITS2序列上并无稳定、明显差异。DNA条形码技术能够准确、快速地对花椒属9种植物进行鉴定。
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