恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)为人工合成的氟喹诺酮类抗菌药物,被广泛用于多种动物感染性疾病的预防和治疗。近多年来,RNR在水生动物疾病的防治中应用愈来愈多。然而ENR的大量使用,可能造成其在动物源食品中的残留,严重影响到人类的身体健康。传统的检测方法中,高效液相色谱等检测,需要复杂的样品前处理,贵重的大型仪器,耗时较久。本研究中将ENR的核酸适配体组装在纳米金(Au nanoparticles,AuNPs)表面作为识别纳米生物探针,结合磁珠(Microbeads,MBs)分离技术构建针对ENR的适配体传感器(aptasensor)。首先通过末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdTase)介导的常温下纳米界面DNA的生长,实现针对ENR的信号响应,建立一种简单易操作的检测分析方法。其次,本研究中结合TdTase介导的纳米界面DNA的生长和RCA扩增技术,实现了一种新型的TdT生成的具有通用引物的RCA的传感分析方法,用于定量检测ENR。本论文主要包括以下三个部分:(1)首先参照经典的还原法制备粒径15 nm的AuNPs,并在纳米金表面组装5’-末端修饰了巯基的aptamer1。在1μm醛基化磁珠表面组装3’-末端修饰氨基的aptamer2,用紫外可见光吸收光谱进行表征。其次,利用两段适配体夹心结构对靶标分子进行识别,并借用荧光分光光度计表征。进一步,两种探针参与TdT扩增,验证是否TdTase只在3’-OH延伸并得到生长产物长单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA),而不会在5’末端起作用。通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像对探针及ssDNA进行了表征。结果表明TdTase能够实现纳米界面上DNA的3’-OH端的高效生长,链长可达850 nm。(2)进一步地,我们将这种DNA的生长策略结合适配体(aptamer)技术应用于ENR的适配体传感器构建研究。建立一种基于TdTase的适配体传感器用于ENR的定量检测。核酸扩增技术中,常用的PCR技术,需要严格的温度控制和特殊的设备。基于TdTase的扩增技术无需复杂的样品前处理,扩增模板和特殊的设备,常温下就能实现DNA的生长延伸。两种探针的双识别机制有助于提高检测的特异性;当捕获到靶标时,肉眼可直接观察靶标捕获后上清液游离的AuNPs的颜色,进而来判断靶标浓度大小;磁珠的引入,使得溶液中的三明治复合结构可直接在磁响应的作用下分离、洗涤。结果显示该传感器对ENR浓度范围0.01~0.1 mg/mL具备良好的响应性能;同时能够明显区分环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等对照组信号。(3)常用的RCA技术,每检测一种靶分子就需要设计特定的引物序列;检测多种靶标分子时,需要设计多种对应的引物。以纳米金为载体的纳米生物探针,纳米金表面需要同时组装探针和引物,多种DNA链存在的情况下,降低了组装效率。该研究进一步将TdT和RCA技术连用,建立一种新型的基于TdT产生的具有通用引物RCA的传感分析方法,用于定量检测ENR。在TdTase的催化作用下,在组装在纳米金表面的DNA末端适当地扩增产生一段只含有A碱基的单链DNA,这段polyA作为引物和环状模板中含有的一段polyT的进行杂交,启动后续的RCA扩增。AuNPs只与一种DNA组装,提高组装效率、降低研究成本;DNA末端TdT扩增产生引物再触发RCA,该反应在等温条件下实现,无需特殊的设备,省去引物的设计。结果表明该传感分析方法能够明显区分环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等对照组信号,在0.01~1000 ng/mL(Y=0.1590+0.0337*X)范围内呈良好的线性关系。统计分析显示ENR的检测限为0.5 pg/mL,且能够同时区分多种靶标分子初步实现了该体系的通用性。