前言 真空冷冻干燥法(以下简称冻干)保存角膜就是预先把角膜内的水分冻结成固态，然后在真空条件下使水直接从固态中升华出来的一种保存方法。冻干保存的角膜，不会受到氧化和细菌污染，可在4℃下长期保存，不需消耗大量能源，室温下可以短距离运输，运输方便。 影响冻干角膜效果的因素涉及方方面面，诸如保护剂系统，预冻温度，降温速率，冷冻干燥条件等。相比之下，保护剂系统对冻干效果的影响尤为突出。这已被国内外众多研究报道证实。加入适宜保护剂系统可在很大程度上避免冷冻干燥对细胞脱水带来的损害。到目前为止，人们发现的低温保护剂有四十余种，依照是否能渗透细胞膜分为穿透性保护剂(膜内保护剂)和非穿透性保护剂(膜外保护剂)。 本研究在其它条件固定的前提下，使用二甲基亚砜、白蛋白为抗冻剂基础上加入不同浓度的蔗糖，评价蔗糖在冻干兔角膜中的价值并探讨其作用机理。 实验材料 1．蔗糖：分析纯，沈阳市试剂三厂生产。 2．二甲基亚砜：SIGNA CHMICAL CO. P. O GERMANY。 3．20％安普莱士(人血清白蛋白)：上海莱士血制品有限公司。 4．实验试剂：茜素红粉 美国生产 上海进口分装。 台盼蓝粉 美国生产 上海进口分装。 5．实验动物：2-3kg大耳白家兔。 6．实验仪器：超静工作台，北京半导体设备一厂生产；电子天 平，型号 AP250D；OLYMPUS光学显微镜；超低温测温仪；箔电 阻：Pt刁；冻干机：ZLG－0．05型i东北大学，沈阳三环真空研究 所研制；制冷源：液氮，冰箱；简易降温仪。 ．实验方法 1 1．保护液的配制：保护液由三种成份组成，20％人血清白蛋 白，二甲基亚矾，蔗糖；配制四组保护液共 240份，每瓶分装2．5 l， 120份用于冷冻实验，120份用于冻干实验。 2．试验分组：本实验采用国外经典C四出。四步法的冷冻保 护剂配方作为对照组。具体分组如下： 表玉 对照组保护液组成，。一 表2 实验组1保护液组成—— ·2· 表3 实验组＊保护液组成 表4 实验组＊保护液组成—— 3．实验步骤：冻干经过冷冻和干燥两个阶段，首先研究蔗糖在冷冻阶段的保护作用；然后考察在干燥阶段中的保护作用。 3．1 冷冻实验 3．1．l 保护液配制：对照组、实验组1＊＊ 各30份，每份2．5毫升。每次实验冷冻工艺流程相同，共做30次实验。 3．1．2 角膜片的制备及冷平衡。 3．二．3 梯度降温、深低温保存。 3．1．4 复温及复温后处理。 3．1．5 角膜内皮细胞活性判定：用台盼蓝与前素红联合染色评价内皮细胞的活性。 3．二．6 计算兔角膜内皮细胞成活率。 ·3· 3．2 冻干实验 3．2．1 保护液配制：对照组、实验组I、11、Ill各30份，每份2．5毫升。每次实验冻干工艺流程相同，共做30次实验。 3．2．2 角膜片的制备及冷平衡。 3．2．3 梯度降温。 3·2．4 真空于燥。 3·2．5 充氮气包装。 3．26 将包装好的冻干角膜置于一20℃冰箱保存。 3·2·7 冻于角膜复水。 3．2．8 角膜内皮细胞活性检测。 3．2．9 计算兔角膜内皮细胞成活率。 实验结果 通过对角膜内皮细胞进行菌素红和台盼蓝联合染色，观察了角膜内皮细胞形态；计算了内皮细胞成活率，并对成活率进行方差分析。 互．冷冻角膜内皮细胞检测结果 1．互 对照组保护液保护的冷冻角膜内皮细胞的检测结果：角膜内皮细胞呈六角形镶嵌排列，大小一致，边界呈桔红色，偶可见淡蓝色圆形或椭圆形细胞核。如附图1所示。平均ESR为96．1％。 二．2 实验组二保护液保护的冷冻角膜内皮细胞的检测结果：内皮细胞呈六角形镶嵌排列，大小一致，边界呈桔红色，偶可见淡蓝色圆形或椭圆形细胞核。如附图二所示。平均ESR为94．0％，经方差分析蔗糖为不显著因素。 ＊3 实验组＊保护液保护的冷冻角膜内皮细胞的检测结果：内皮细胞呈六角形镶嵌排列，大小一致，边界呈桔红染色，可见 ·4·淡蓝色圆形或椭圆形细胞核。如附图3所示。平均ESR为95．2％，经方差分析蔗糖为不显著因素。 1．4 实验组＊保护液保护的冷冻角膜内皮细胞的检测结果：菌素红染色见到部分内皮细胞轮廓，部分内皮细胞膜溶解，大片状红染。如附图4所示。平均ESR为40．7％，经方差分析蔗糖为显著因素。 2．冻于角膜内皮细胞检测结果 2．1 对照组保护液保护的冻于角膜内皮细胞的检测结果：部分内皮细胞裂脱，与后弹力层分离，细胞呈片状红染，可见部分内皮细胞轮廓。如附图6所示