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研究背景：前列腺癌是威胁人类健康的重要疾病，特别进展到雄激素非依赖期的前列腺癌目前仍然没有特别有效的治疗方法。免疫治疗很可能成为治疗前列腺癌的很有前景的一种方法。DNA疫苗作为免疫治疗的一种方式，已经在临床前和临床实验中进行了广泛的研究，DNA疫苗具有安全性好、特异性高以及易于产业化生产等方面的优势正在成为前列腺癌免疫治疗的重要发展方向。但是，DNA疫苗也存在转染效率低下，诱导的免疫反应较弱的缺点，本研究我们通过对靶抗原的选择，佐剂的应用以及递送方式的改进等方面来加强DNA疫苗诱导的免疫反应，为前列腺癌DNA疫苗的免疫增效进行探索性研究。研究目的：本研究将前列腺干细胞抗原（PSCA）和免疫佐剂IL-12共同构建到同一真核表达载体中成为新型的前列腺癌DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12，通过电穿孔的方法递送疫苗到小鼠体内，观察DNA疫苗的抑瘤效果并对其可能的免疫学机制进行初步的探讨。方法：1.将PCR方法扩增的mIL-12基因其克隆到pVAX1-IRES载体中IRES序列的下游构建免疫增效载体pVAX1-IRES-mIL-12，在此基础上将RT-PCR方法从RM-1细胞系中扩增的mPSCA基因克隆到该质粒IRES的上游，构建前列腺癌DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12。质粒体外转染293T细胞后分别通过Western Blot验证mPSCA的表达，ELISA法验证mIL-12的真核表达；电穿孔法递送质粒到小鼠体内验，分别验证mPSCA和mIL-12基因的活体内表达。本部分中还构建了pVAX1-mPSCA质粒作为新的DNA疫苗的对照，验证了其体内外的表达情况。2.将mPSCA基因去除信号肽后构建到原核表达载体pet-42a中，IPTG诱导并纯化mPSCA蛋白，通过Western Blot和ELISA检测纯化后的mPSCA蛋白的免疫原性。3.将所构建的DNA疫苗采用电穿孔肌肉内注射的方式免疫小鼠，观察所构建的DNA疫苗的抑瘤效果，并对其相关的免疫学机制进行初步的研究：采用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异抗体滴度和血清中的细胞因子的水平；采用LDH法体外检测免疫小鼠细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应；采用ELISPOT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ的分泌；采用流式细胞术检测免疫小鼠的离体肿瘤组织内的肿瘤浸润淋巴细胞；对全身其他器官进行病理组织切片染色（HE）观察疫苗免疫后小鼠其他组织有无炎症反应和组织损伤。结果：1.酶切及测序结果证实成功构建了pVAX1-IRES-mIL-12、pVAX1-mPSCA和pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12质粒，并且证实了各个质粒在体外和体内均可以有效表达。2.酶切和测序结果证实成功构建原核表达质粒pET-42a-mPSCA，诱导并纯化出大小约为40KD的融合蛋白；Western Blot和ELISA检测显示纯化后的mPSCA蛋白具有免疫原性。3.观察不同质粒免疫后的小鼠移植瘤生长趋势，发现与对照组相比DNA疫苗组成瘤时间延长3d；疫苗组小鼠肿瘤生长受到明显抑制，肿瘤抑制率达77.96%。DNA疫苗组小鼠体内产生的特异性抗体滴度大于12800；可以检测到疫苗组小鼠血清细胞因子IL-12和IFN-γ的增加，淋巴细胞特异性的IFN-γ的分泌达2430.00±157.36SFU/106个脾淋巴细胞；疫苗组淋巴细胞与对照组相比对肿瘤细胞的杀伤效率明显增加，在效靶比为40:1、20:1和10:1时，CTL的杀伤率分别为33.19±0.24%、26.67±0.73%和20.44±0.26%。在疫苗组免疫的小鼠肿瘤组织中可以检测到CD8+T细胞的浸润。疫苗免疫后小鼠中低量表达PSCA抗原的正常组织病理切片中没有发现自身免疫性炎症反应和组织损伤的证据。结论：本研究在靶抗原的选择、佐剂的应用、DNA递送方式等方面为DNA疫苗的免疫增效研究做出了新的尝试。所构建的新型免疫增效DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12与其他对照组相比在小鼠体内可以诱导产生更强的特异性细胞和体液免疫反应，能够抑制前列腺癌移植瘤的生长，并且证实用该疫苗免疫小鼠是安全的，为前列腺癌DNA疫苗的免疫增效的研究提供了一些有益的借鉴。