【目的】借助动态培养系统构建骨髓间充质干细胞（Bone marrow-mesenchymal stem cell,BM-MSC）三维复层细胞片,并在大鼠心肌梗死（Myocardial infarction,MI）模型中研究其治疗效果与相关机制。【方法】使用磷脂酶A₂脱细胞方法制备脱细胞猪心包膜（Decellularized porcine pericardium,DPP）,借助天冬氨酸（Aspartic acid,Asp）在DPP上交联VEGF。使用RAD16-I水凝胶搭建BM-MSC三维复层结构,分别在动态培养系统及传统静态培养条件获得动态培养细胞片（Dynamic culture cell sheet,DCcs）及静态培养细胞片（Static culture cell sheet,SCcs）,检测细胞的三维结构、增殖、凋亡及生长因子水平。在大鼠MI模型中,评价DCcs与SCcs 4周内对大鼠梗死心肌的疗效,追踪BM-MSC体内存活情况。【结果】DPP中异种细胞成分被高效去除,天然胶原被完整保留。借助Asp在DPP上以共价交联方式构建DPP-Asp-VEGF支架,VEGF 7天内稳定释放。在细胞片体外培养48 h后,与SCcs相比,DCcs中细胞密度更高,细胞均匀分布,且BM-MSC维持了较好的增殖、生长因子分泌及干细胞标记物表达水平,细胞凋亡率显著减少。体内结果显示,与MI对照组相比,DCcs显著减少梗死心肌面积、改善心功能,促进血管新生;与SCcs相比,DCcs组显著提高BM-MSC体内4周存活率。【结论】使用三维动态培养系统构建得到的DCcs可维持良好的干细胞生物学活性,在大鼠MI模型中DCcs有效减少梗死心肌面积、改善心功能并促进梗死区血管新生。