目的:慢性牙周炎首先出现牙龈炎症,继而引起附着丧失,最终导致牙齿的松动脱落。恢复或再生破坏的牙周组织是牙周治疗的主要目标,牙周原位组织工程的目的也是致力于此。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是组织工程中促进牙周组织再生的一种理想的细胞来源,具有多向分化潜能,经体外诱导,可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等。然而,牙周炎所造成的炎症环境导致PDLSCs数量减少,增殖和成骨分化能力也有所降低。因此,增加PDLSCs的数量和提高其生物学活性有益于促进牙周组织的再生。细胞因子、趋化因子和粘附分子等已被用于促进牙周组织再生。然而,这些生长因子价格昂贵,在口腔环境中缺乏良好的稳定性,因此需要进一步探究适宜的生长因子。雌激素已确定在骨再生中起着重要的调节作用,它可以通过与雌激素受体结合参与调节骨的代谢。并且研究表明,牙龈和牙周膜上有雌激素受体的表达。催产素(oxytocin,OT)可以参与调节雌激素对骨骼的合成作用。OT的受体(oxytocin receptor,OTR)在许多不同类型的细胞如成骨细胞和脂肪细胞等均有表达,可以通过与OT结合发挥对骨代谢的调控作用。OT可通过控制人间充质干细胞的分化从而调节成骨细胞和脂肪细胞在体内的平衡,OT还可以逆转去势大鼠模型的骨质疏松。OT可通过上调骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)促进成骨细胞分化为矿化表型。牙周组织的破坏,尤其是牙槽骨的吸收与激素水平紧密相关,绝经后雌激素的减少与牙槽骨吸收的增加具有密切的相关性,而血清OT的显著下调可能导致绝经后妇女的骨质疏松。因此,我们推测OT可能在调节牙周组织再生中发挥作用。在本研究中,我们用OT作用于体外培养的PDLSCs来检测其对PDLSCs的增殖、迁移和成骨分化的作用并进行可能的机制的探讨。方法:(1)PDLSCs分离培养鉴定及OTR的检测:利用组织块培养法获得原代细胞,P3-P5的细胞供后续实验使用。利用有限稀释法,选取单克隆获得的具有干细胞特性的PDLSCs进行传代培养。对分离纯化的PDLSCs用流式细胞仪检测细胞表面间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和造血干细胞(hemopoietic stem cell,HSCs)源性表面标志物的表达。免疫荧光染色检测PDLSCs有无OTR的表达。(2)细胞活性的检测:根据细胞活性检测试剂盒(cell-counting kit 8,CCK8)说明书检测0、10、50、100 nM OT对PDLSCs增殖的影响。(3)细胞迁移能力的检测:Transwell检测50nMOT、100nM OT、50nMOT+200 nM 催产素受体拮抗剂(OT receptor antagonist,OTA)、100 nM OT-+ 200 nM OTA对PDLSCs迁移作用的影响。(4)细胞成骨分化能力的检测:用茜素红钙盐染色法检测0、10、50、100nM OT作用PDLSCs成骨诱导21 D后矿化结节形成的情况,并用西吡氯铵(cetylpyridinium chloride,CPC)比色法进行钙含量的定量分析;用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测 0、10、50、100 nM OT作用PDLSCs成骨诱导7、14和21 D后,对相关成骨基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ 型胶原(Collagen Ⅰ,Coll Ⅰ),runt 相关转录因子 2(runt related transcription factor 2,Runx2),骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨涎蛋白(osteocalcin,OCN)表达的影响;用Western blot检测0、10、50、100 nM OT作用下,PDLSCs成骨诱导7和14 D后对相关成骨蛋白ALP、ColⅠ和Runx2表达的影响。(5)OT对PDLSCs成骨分化机制的探究:用Western blot检测50 nM OT作用于PDLSCs 0、2、5、10、15、30 和 60 min 后对细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK),蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信号通路的作用。结果:(1)PDLSCs分离培养鉴定及OTR的检测:PDLSCs通过有限稀释法分离培养;分离培养的PDLSCs阳性表达MSCs源性表面标志物CD29和CD73,阴性表达HSCs源性表面标志物CD45;免疫荧光检测到PDLSCs表面表达OTR,且受体表达情况随OT浓度的增加而增强。(2)CCK8结果表明OT对PDLSCs无明显细胞毒性,50 nM OT可显著促进PDLSCs 的增殖(P<0.05)。(3)Transwell结果表明50、100 nM OT可促进PDLSCs的迁移(P<0.005),且100 nMOT促进迁移作用显著优于50nMOT。加入OTA后,50和100 nMOT促进迁移的作用明显受到抑制,表明OT促进PDLSCs迁移是与OTR结合后产生的。(4)成骨分化能力的检测:茜素红染色及钙定量染色结果表明10和50 nM OT在21 D显著促进矿化结节的形成(P<0.01),qRT-PCR和Western blot表明OT可促进相关成骨基因ALP、Col Ⅰ、Runx2、OPN和OCN(P<0.05)与相关成骨蛋白ALP、Col Ⅰ和Runx2的表达(P<0.01),其中50 nM OT促进作用最明显。(5)50 nM OT可在作用PDLSCs 2 min后激活ERK和AKT通路,抑制PI3K通路,提示OT促进PDLSCs成骨分化是由ERK和AKT信号通路参与的。结论:实验结果表明OT可在体外促进PDLSCs增殖,迁移和成骨分化,此研究为牙周再生治疗提供新思路。