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第一部分先天性黑蒙症致病基因Nmnat1复合杂合突变小鼠各组织中nmnat1与sirt1基因表达研究背景:先天性黑蒙症（Leber’s congenital amaurosis,LCA）是一类导致视网膜病变的眼部疾病,患儿一般在出生时或出生一年后呈现严重的视力障碍。该病多是常染色体隐形遗传病,目前研究报道了约18种与先天性黑蒙相关的致病基因。本课题组通过高通量测序和外显子捕获技术,发现了 NMNAT1基因突变会导致9型先天性黑蒙症发生。NMNAT1基因通过编码一类催化NAD+合成的关键酶类—烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶,参与NAD+依赖的多种代谢过程。SIRT1是一类NAD+依赖的去乙酰化酶,可进行NAD+依赖性的去乙酰化反应,并参与代谢疾病,恶性肿瘤,心血管疾病以及神经性疾病等多种疾病的调节机制。研究报道显示,NMNAT1基因可与SIRT1直接相互作用,将NAD+转移至SIRT1,从而发挥去乙酰化功能。由此可见,NMNAT1蛋白与SIRT1蛋白之间是紧密联系的。目的:研究发现NMNAT1蛋白在多种组织中广泛表达,其中在视网膜,肝脏,睾丸,骨骼肌等组织中表达量较高。本文通过选取NMNAT1基因突变（c.769G>A和c.454G>T）位点敲入小鼠来研究NMNAT1与SIRT1在成年突变小鼠全身各组织脏器中表达水平的差异和组织学水平的异常。以期了解NMNAT1基因突变对除眼睛外其它组织的损伤情况。方法:建立NMNAT1基因（c.769G>A和c.454G>T）复合杂合突变的小鼠模型。小鼠出生一周后剪取尾巴或脚趾提取基因组DNA,通过Sanger测序验证小鼠基因型。NMNAT1基因（c.769G>A和c.454G>T）复合杂合突变小鼠和对照组同时培育至20周（之前实验室研究发现20周老鼠黑蒙症表型最为严重）,解剖收集各组织获取组织RNA,并通过荧光定量PCR技术检测小鼠各组织RNA表达水平的差异。选取差异较大的组织,运用免疫组化检测蛋白表达位置及水平变化,HE染色结果观察相应组织细胞是否有形态学病理学上的病变结果:NMNAT1基因（c.769G>A和c.454G>T）复合杂合突变小鼠的NMNAT1和SIRT1基因在肝脏和睾丸的组织的表达量明显下调,并表现出显著的统计学差异,在其他组织包括眼睛,肌肉,心脏,肾脏等中没有显著差异。免疫组化结果同样显示突变小鼠NMNAT1和SIRT1表达水平下调。HE染色结果表明突变小鼠的睾丸和肝脏组织形态学结构改变。结论:先天性黑蒙症致病基因NMNAT1（c.769G>A和c.454G>T）复合杂合突变除了对于视网膜造成严重损伤外,同时会对于肝脏组织和睾丸组织带来一定程度的损伤,这两个组织的严重损伤可能是由于NMNAT1基因突变引起SIRT1表达异常所导致。第二部分SMN1基因新发突变导致脊髓性肌萎缩症（SMA）背景:脊髓性肌萎缩（Spinal muscular atrophy,SMA）是一类常染色体隐性遗传病,常伴随有运动神经元的退行,骨骼肌的萎缩以普遍的肌肉无力。该病主要由于神经元存活基因（Survival motor neuron1,SMN1）发生缺失或突变所导致。目的:在本研究中我们收集了 3个脊髓性肌萎缩症的患病家系,通过多种筛查手段探测家系中的先证者致病信息以及携带者信息,为这些家系后期的遗传咨询和产前诊断提供临床实验室依据。方法:采集先证者以及先证者亲属外周血样并获取全基因组DNA,运用荧光定量PCR技术进行SMN1基因拷贝数筛查。全血RNA提取并反转录为cDNA,通过设计合适引物和Sanger测序检测家系中的致病点突变。质粒构建以及后续的细胞实验验证点突变造成SMN蛋白定位和功能上的改变,并结合生物信息学来说明点突变导致蛋白结构异常以及致病性。结果:发现了一个SMN1基因新的突变位点c.728-729delTT（p.Ile243Thrfs12）,该突变会导致第243位氨基酸从异亮氨酸转变为苏氨酸并且提前终止形成截短蛋白。细胞定位实验表明该突变会造成SMN蛋白定位异常。再结合蛋白功能预测分析结果确定突变c.728729delTT为致病突变。另外,在筛查一个家系的携带者时发现了中国家庭中罕见的“2+0”模式（即一条染色体上带有2个SMN1基因,另一条染色体上没有SMN1）。最后一个家系的先证者为常见的SMN1基因7号外显子缺失。结论:本课题组发现了 一个未曾被报道过的SMN1基因新发突变c.728729delTT（p.Ile243Thrfs12）,经过细胞学实验验证以及生物信息分析均表明该突变为致病突变。另外罕见的“2+0”模式为未来中国临床上筛查SMA提供了可靠的参考依据。