研究背景与目的喉癌是危害人体健康和生命的恶性肿瘤,约占耳鼻咽喉恶性肿瘤的10-35%,其中以喉鳞状细胞癌(LSCC)最为多见,可达90%。喉癌在我国东北地区是高发区,而且逐年增长。目前,喉切除术是治疗喉癌的主要手段,但术后对患者的生活质量会产生较大影响,且对于晚期及全身状态不佳的患者无法有效实施,虽可辅以放疗及化疗,效果仍不理想。因此,深入探讨喉癌的发生机制,寻找利用基因干预的手段进行治疗是目前喉癌研究的热点。Skp2基因是最近发现的癌基因,与肿瘤的增殖、分化有关。在对喉癌的研究中发现,Skp2表达与临床分期及淋巴结转移正相关,提示该基因表达上调可能与LSCC的侵袭转移能力密切相关；同时,其表达与抑癌基因p27表达强度呈明显负相关,表明在LSCC的进展过程中,Skp2表达的上调可能通过泛素—蛋白酶体途径导致p27表达减少,使其不能有效发挥细胞周期负调控因子的抑癌作用,促使癌细胞获得更高的侵袭转移能力。因此,我们推测Skp2可能是喉部恶性肿瘤基因治疗的靶点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法,它比反义寡核苷酸技术能更高效地抑制目的基因的表达。已有研究证实化学合成siRNA (small interfering RNA)能高效地介导RNAi作用,但作用持时间短,而采用siRNA表达载体尤其是慢病毒载体的方法能有效延长作用时间。本研究试图通过细胞体外及动物体内试验,利用慢病毒介导的RNA干扰技术抑制癌基因Skp2的表达,观察其对人喉癌细胞系Hep-2细胞的增殖、调亡以及对抑癌基因p27表达的影响,为今后应用该技术研究和治疗喉癌提供实验依据。方法1、针对人Skp2基因的RNAi载体构建利用计算机辅助设计软件,设计合成四条针对Skp2基因cds区的siRNA序列,同时设计一条对于任何基因无干扰效果序列Negative用于对照组实验,并将其定向克隆入真核表达载体pSIHl-Hl-copGFP shRNA Vector,获得五个重组质粒：pSIHl-negative、pSIHl-siRNA1、pSIH1-siRNA2、pSIHl-siRNA3、pSIH1-siRNA4。2、抑制Skp2表达对人喉癌细胞系Hep-2影响的体外实验(1)在Hep-2细胞中针对Skp2基因筛选有效的干扰序列：利用脂质体将重组质粒转染Hep-2细胞,荧光实时定量PCR实验检测转染前后细胞中的Skp2 mRNA的变化,根据结果选择一个含有最强抑制效果的干扰序列的质粒用于后续试验；(2)用慢病毒系统建立干扰Skp2基因的稳定细胞株：以三载体包装的含有筛选出的pSIH-siRNA3和pSIH-negative质粒的慢病毒原液感染Hep-2细胞,观察转染效果,获得Hep2-siRNA, Hep2-neg两组稳定转染细胞株；(3)荧光实时定量PCR检测稳定转染细胞株中Skp2和p27 mRNA的表达；(4) Western blot法检测Hep2, Hep2-siRNA, Hep2-neg三组细胞中的Skp2和p27蛋白表达量的变化；(5)MTT法检测Hep2, Hep2-siRNA, Hep2-neg三组细胞的增殖情况；(6)流式细胞仪检测三组细胞凋亡情况。3、抑制Skp2表达对人喉癌细胞系Hep-2影响的体内实验(1)裸鼠随机分成三组,将三组细胞按照1.0×107个/ml的浓度,每只鼠0.2ml背部皮下接种；(2)观察裸鼠的成瘤情况,30天后处死裸鼠,经皮下剥离肿瘤组织,比较各组瘤体大小和瘤重；(3)将瘤组织切片进行常规病理检查,并采用免疫组化方法对三组裸鼠瘤组织中Skp2和p27蛋白的表达进行检测。1、利用PCR分析,DNA测序证实靶向Skp2特异性siRNA表达载体pSIHl-negative、pSIHl-siRNA1、pSIHl-siRNA2、pSIH1-siRNA3、pSIH1-siRNA4重组质粒已成功构建。2、五组重组质粒转染Hep-2细胞后对Skp2 mRNA抑制率分别为12%,42%,14%,46%和29%,但细胞转染效率不高,仅为50%左右；重组质粒pSIH1-siRNA3对Hep-2细胞Skp2基因的抑制作用最强。3、应用慢病毒包装系统包装pSIH1-negative和pSIHl-siRNA3质粒后以病毒原液感染Hep-2细胞,转染效率可提高至90%左右,且转染细胞株可稳定传代培养。4、应用荧光实时定量PCR检测Hep2, Hep2-siRNA, Hep2-neg三组细胞中的Skp2和p27 mRNA表达量的变化,显示Hep2-siRNA细胞中Skp2 mRNA表达量与Hep2组细胞中的表达量相比下调了74%,而p27 mRNA表达量则上调了38%,Hep2-neg组无明显变化。5、Western blot法检测Hep2, Hep2-siRNA, Hep2-neg三组细胞中的Skp2和p27蛋白表达量的变化,显示Hep2-siRNA细胞中Skp2蛋白表达量与Hep2组细胞中的表达量相比下调了约76%,p27蛋白表达量则上调了约89%,Hep2-neg组无明显变化。6、MTT法检测细胞生长增殖情况结果显示Hep2-siRNA组细胞增殖明显减慢,而Hep2-neg组细胞与Hep2组相比,细胞增殖无明显变化。7、流式细胞仪检测结果显示Hep2, Hep2-neg和Hep2-siRNA三组细胞凋亡率分别为(2.86±0.21)%,(3.58±0.16)%和(16.64±0.17)%, Hep2-siRNA组与其他两组比较细胞凋亡率明显增加,Hep2-neg组和Hep2组之间无显著差异。8、裸鼠成瘤实验显示与两对照组相比,转染阳性质粒组细胞裸鼠致瘤活性明显降低,生长减慢,瘤体体积明显较小；而转染阴性质粒组细胞裸鼠致瘤性及生长活性与正常培养组相比无明显差异。接种后30天转染阳性质粒组瘤体重量较对照组明显减轻,抑瘤率为79.55%；而转染阴性质粒组细胞裸鼠致瘤体重量与正常培养组比较无明显差异。9、荷瘤裸鼠瘤体HE染色切片结果显示正常培养组及转染阴性质粒组肿瘤组织中央可见坏死灶,癌细胞增生活跃,癌巢形成明显,瘤组织以实质为主,间质少见；转染阳性质粒组瘤体中央坏死减少,肿瘤组织间质较多见。正常培养组及转染阴性质粒组比较,瘤体病理学特征无明显差异。10、荷瘤裸鼠瘤体免疫组化结果显示正常培养组及转染阴性质粒组肿瘤组织中Skp2蛋白高表达,p27蛋白表达显著下调；转染阳性质粒组裸鼠瘤体中Skp2蛋白表达明显减弱,p27蛋白表达显著上调。结论1、针对Skp2基因设计的慢病毒介导的siRNA表达载体能从mRNA和蛋白水平特异、高效地抑制人喉癌细胞系Hep-2中癌基因Skp2的表达,并上调抑癌基因p27的表达；同时,抑制肿瘤细胞的恶性增殖,增加其凋亡率。2、在喉癌的发生发展中,Skp2与p27的表达呈明显负相关,靶向Skp2基因的siRNA对Hep-2细胞的抑制作用可能是通过上调p27基因水平来实现的。3、利用RNA干扰技术抑制Skp2的表达有望成为喉癌基因治疗的合理策略之一。