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研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)易损斑块是大多数急性冠脉综合征以及脑卒中的常见病理改变。阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)是一类睡眠-呼吸紊乱性疾病。研究表明,OSA患者合并AS将会使得AS斑块预后更差。再者,相关研究发现Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和核因子κappa B(Nuclear factorκappa B,NF-κB)在OSA及AS的发病中起关键作用。然而,究竟OSA是否加速AS进展以及TLR4/NF-κB信号通路在其中所起的具体分子机制,目前仍未见相关报道。研究目的OSA典型的病理生理特征是间断缺氧(intermittent hypoxia,IH),所以我们通过制造IH的环境来模拟OSA的病理生理过程。本课题采用ApoE-/-小鼠为载体构建了早期AS模型,再经过IH处理,进而观察IH暴露对小鼠主动脉斑块负荷、易损性变化以及其中TLR4、NF-κB和下游主要炎症分子表达差异的影响,并利用TLR4干扰技术深入阐述TLR4/NF-κB信号通路在其中的致病机制,以期为临床防治OSA合并易损斑块提供实验依据。方法1.TLR4干扰慢病毒的合成:通过si RNA的筛选,选择其中干扰效果最高的TLR4-siRNA序列并重组到慢病毒(lentivirus,LV)载体上。经体内转染并观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达强度。2.体外细胞分组及处理:首先筛选出对内皮细胞TLR4表达影响较为明显的缺氧/复氧时间点,再将细胞分为空白对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+空白慢病毒组、缺氧/复氧+TLR4干扰慢病毒组。3.动物实验分组及处理:将apoE-/-小鼠随机分为假间断缺氧组(n=15)(Sham),间断缺氧组(n=15)(IH),间断缺氧+空白慢病毒组(n=15)(IH+LV-EGFP)和间断缺氧+TLR4干扰慢病毒组(n=15)(IH+LV-TLR4i)。先诱导出小鼠主动脉壁的早期AS斑块病变再进行病毒转染,最后给予间断缺氧处理。4.体重、血压监测:分别于IH前、后进行小鼠称重及尾动脉血压测量。5.血清炎性因子及生化指标检测:采用Elisa法检测TNF-α及IL-6的含量;血生化检测血脂四项及血糖。6.病理学检测:对主动脉主干斑块病变进行大体油红O染色;主动脉窦冰冻切片分别进行H&E染色、油红O染色、天狼猩红染色、免疫组化等染色,观察指标如下:(1)主动脉慢病毒转染效果:荧光显微镜观察主动脉窦EGFP的表达强度;(2)主动脉树斑块病变:大体油红O染色观察主动脉树内壁的大体斑块病变;(3)斑块面积:主动脉窦切片H&E染色观察斑块病变横截面积;(4)免疫组化分析主动脉窦斑块内TLR4、NF-κB的定位表达;(5)斑块不稳定性:分析斑块内脂质、单核细胞&巨噬细胞、平滑肌肌动蛋白、I型胶原纤维含量,计算斑块不稳定性指数的公式为(单核细胞&巨噬细胞+脂质)阳性面积百分比/(平滑肌肌动蛋白+I型胶原纤维)阳性面积百分比。7.分子生物学分析(1)Western blot检测:提主动脉总蛋白,Western blot法检测血管内TLR4、p65、p-p65、IL-1β、HIF-1α、Nox-2、p38、p-p38蛋白表达;提取内皮细胞总蛋白,检测细胞内TLR4、p65、p-p65蛋白表达。(2)实时定量RT-PCR检测:提取总RNA,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测血管壁内及内皮细胞内TLR4的表达水平。结果1.与对照组相比,缺氧6小时后复氧12小时处理(H6/R12)组的细胞TLR4蛋白水平最高(p<0.05)。2.H6/R12组TLR4 mRNA、蛋白表达水平及p65的磷酸化水平均明显高于对照组(p<0.05)。3.H6/R12处理后,TLR4干扰组TLR4 mRNA、蛋白表达水平以及p65的磷酸化水平明显低于空白慢病毒组(p<0.05)。4.主动脉窦AS斑块内慢病毒转染荧光强度显著增强。5.IH暴露前组间小鼠体重差异无统计学意义。IH处理后,IH组体重较Sham组明显下降(p<0.05),IH+LV-TLR4i组小鼠体重未见显著下降(p<0.05)。6.IH暴露前,四组小鼠间的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)差异无统计学差异;IH暴露后,与Sham组相比,IH组小鼠SBP和DBP均明显上升(p<0.05),IH+LV-TLR4i组较IH+LV-EGFP组血压变动无统计学差异。7.IH组小鼠血清总胆固醇、LDL-C、HDL-C、血糖水平均较Sham组明显升高(p<0.05),而IH暴露对TG水平影响不显著;与IH+LV-EGFP组相比,IH+LV-TLR4i组小鼠血清总胆固醇、LDL-C水平显著降低(p<0.05),而HDL-C、TG、血糖变化无统计学差异。8.与Sham组相比,IH暴露增加主动脉壁TLR4、p-p65、IL-1β、HIF-1α、Nox-2、p-p38的表达水平,同时也增加了NF-κB的核内聚集及血清IL-6、TNF-α的含量;通过降低内源性TLR4表达,IH的这种作用明显减轻(p<0.05)。9.IH组小鼠主动脉斑块负荷较Sham组显著增大(p<0.05),IH+LV-TLR4i组斑块负荷比IH+LV-EGFP组降低了3倍(p<0.05)。10.与Sham组比较,IH组小鼠斑块易损指数显著增加(p<0.05);TLR4干扰逆转IH的这一作用(p<0.05)。结论1.H6/R12处理通过TLR4信号转导诱发内皮细胞内促炎转录因子NF-κB的活化;2.IH暴露可放大主动脉斑块内的炎症反应强度、诱发糖脂代谢紊乱及升高血压,从而增加斑块负荷及斑块不稳定性;3.IH暴露促发主动脉斑块TLR4/NF-κB通路及其下游炎症活化是导致AS斑块进展加速的关键分子机制,此研究结果为深入阐述OSA在AS进展方面新的发病机制及潜在治疗靶点提供了新的思路。