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近年来,随着经济水平的提高和生活节奏的加快,冷冻食品以其方便快捷的优点,受到广大消费者的青睐,并成为人们日常生活中最为常见的食品。然而冷冻食品也存在安全问题,从冷冻食品污染情况来看,沙门氏菌的检出率非常高。在冷冻食品中,沙门氏菌会呈现死亡、亚致死、未损伤三种状态。处于亚致死状态的沙门氏菌并未被完全杀死,在适宜的环境下能够自我修复并且恢复到正常的状态,很可能导致食品的二次污染,必须引起足够的重视。本文以鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium为研究对象,研究了-20℃低温诱导沙门氏菌进入亚致死状态以及亚致死细胞复苏现象,并探讨了快速检测冷冻肉制品中活性沙门氏菌的分子检测方法,主要研究内容如下:(1)-20℃低温诱导沙门氏菌进入亚致死状态。平板计数法和LIVE/DEAD Baclight试剂盒检测结果证明了亚致死细胞的存在。利用扫描电镜SEM观察冷冻前后沙门氏菌的外部形态,结果发现冷冻引起细胞结构的显著变化。在整个冻藏期,无论是在标准培养基还是在猪肉、牛肉、牛奶和鸡蛋等食品基质中,细胞总数均随时间的延长而下降,亚致死率始终维持在90%以上。研究还发现37℃环境下培养至对数期的沙门氏菌经过15℃2 h的冷激处理,可使猪肉、牛肉、牛奶和鸡蛋等冷冻食品中沙门氏菌的亚致死率从90%降至60%。(2)分析亚致死细胞敏感性和亚致死细胞的复苏过程。与未处理的细胞相比,亚致死细胞对50℃的温热、酸和溶菌酶的敏感性显著增强。亚致死细胞可在标准培养基(TSB)和磷酸缓冲液(PBS)完成复苏过程,所需时间分别为1 h和2 h。亚致死细胞还可在猪肉、牛肉、鸡蛋、牛奶食品基质中修复,完成复苏时间分别为3 h、2.5 h、2 h、1.5 h,复苏速度与培养物营养物质的丰富程度呈正相关。复苏速度还与培养液pH相关,当pH低于5.0时,亚致死细胞无法复苏,pH在5.0-8.0范围内,复苏速度随着pH的增大而加快。通过向磷酸缓冲液中添加叠氮化钠、氯霉素、利福平、青霉素和变蓝菌素等代谢抑制物,研究发现冷冻处理诱导产生的亚致死细胞的复苏过程涉及能量代谢、RNA合成,与蛋白质合成、肽聚糖合成、脂质合成无关。此外,Mg离子参与复苏过程。(3)SD-PMA-qPCR快速检测冷冻肉制品中活性沙门氏菌。为了解决PMA-qPCR技术对于冷冻样品活菌检测易出现假阳性的问题,引入并优化脱氧胆酸钠(SD)的预处理过程:对冷冻样品以0.1%SD孵育20 min。脱氧胆酸钠可降低损伤菌的细胞膜稳定性,帮助PMA渗入细胞内,实现对膜损伤细胞DNA在PCR扩增的抑制。人工染菌冷冻猪肉样品活性沙门氏菌的检测试验验证了研究建立的SD-PMA-qPCR检测方法,其准确性不受非目标菌存在的影响,灵敏度也稳定在102 cfu/g。