兽医临床常见致病菌对抗菌药物的耐药率正呈逐年上升趋势,且呈多重耐药性。致使细菌获得多重耐药的因素有很多,最常见的是主动外排泵耐药机制。其中,21世纪初新发现的oqxAB基因可编码主动外排泵,介导多重耐药,致使致病菌对喹嗯啉类、氟喹诺酮类及氯霉素类等抗菌药物敏感性降低。前期研究发现其在国内养殖厂中广泛流行,主要存在于肠杆菌科的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和沙门氏菌中,近几年oqxAB在人医临床也得以发现,怀疑因喹噁啉类药物在动物的使用过程中选择出对喹噁啉类、喹诺酮类耐药的细菌,并通过食物链传递给人类病原菌；近年来研究学者将其归入质粒介导的喹诺酮类药物耐药(PMQR)家族,属于RND家族。由质粒编码可在不同种细菌间水平传播和转移,增强了oqxAB主动外排基因的广泛流行,而当前国内外对主动外排泵oqxAB基因的研究仍处于发展阶段,相关资料报道较少,存在许多研究空白。而加强oqxAB主动外排耐药基因的流行调查及其传播机制研究,将具有较强的现实意义和创新价值：一是丰富和补充oqxAB的流行病学内容,有助于掌握oqxAB基因在人医和兽医临床的分布情况；二是探索oqxAB主动外排泵对多重耐药现象的贡献作用；三是探索或掌握其传播机制,有利于切断传播途径或控制传染源,降低多重耐药菌株的传播和扩散,其意义深远,更对公共卫生安全、人类健康保护作用重大。基于此,本课题开展以下多项研究：(一)采用VITEK-32全自动细菌鉴定系统,从河南省郑州、焦作、登封、济源等不同地区的不同养殖厂和宠物医院进行临床致病菌的分离、鉴定。并对获得的临床菌株按照CLSI(2010)提供的方法和标准进行常用抗菌药物的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concertration,MIC)值测定,判定临床致病菌对常用药物的敏感率和耐药率,对比分析不同源菌株的多重耐药情况。结果共分离、鉴定获得136株动物源大肠杆菌,其中宠物犬源53株、猫源4株、兔源32株、鸵鸟源25株和鸭源22株；另外自河南省人民医院医学检验科获赠50株河南省人源致病性大肠杆菌。选择以下抗生素及抗菌药测定药物敏感性：β-内酰胺类(头孢噻呋、头孢噻呋／舒巴坦、头孢曲松)、喹嗯啉类(喹乙醇、痢菌净)、氯霉素类(氟苯尼考)、氟喹诺酮类(环丙沙星、加替沙星)、氨基糖苷类(阿米卡星)、多粘菌素类(多粘菌素E)和四环素类(四环素和多西环素)等七大类共12种。结果显示：27.3%-92.0%的动物源大肠杆菌对三代头孢呈现耐药,96%以上菌株呈现四种及其以上耐药,最严重的是同时对9种以上药物呈现出耐药性,多种耐药情况较为严重的是兔源大肠杆菌(14.81%耐9种药以上)和鸵鸟源大肠杆菌(40%耐9种药),而鸭源和犬源大肠杆菌中未见9种以上的耐药现象,25%的犬源大肠杆菌株呈现8种耐药,27.27%的鸭源大肠杆菌呈现6种耐药,同时40.9%的鸭源和15.0%的犬源大肠杆菌在对喹乙醇耐药的同时,也对环丙沙星和氟苯尼考耐药。50株人源大肠杆菌的多重耐药现象则更为严重,>≥80.75%的菌株呈现出8种以上耐药,最常见的是9种耐药(占34.61%)。(二)根据GenBank公布的携带oqxAB基因的质粒pOLA52的全基因序列,设计特异性引物,采用PCR定位法进行oqxAB基因阳性率检测。结果显示6种不同源大肠杆菌中,主动外排泵oqxAB基因阳性率最高的犬源大肠杆菌,阳性率达100%,其次是兔源大肠杆菌,阳性检出率为82.1%,而鸵鸟源大肠杆菌与猫源大肠杆菌的检出率则比较接近,分别为76%和75%;oqxAB阳性检出率最低的是鸭源大肠杆菌,为45.5%；其中有1株鸭源大肠杆菌在检测到oqxA基因阳性时,三次重复未检测到oqxB基因阳性。人源大肠杆菌oqxAB基因的阳性率为64%,除高于鸭源大肠杆菌的携带率以外,低于其他4种动物源大肠杆菌的oqxAB基因携带率。其中鸵鸟源、兔源、犬源和猫源大肠杆菌的oqxAB基因检测属于首次发现和报道。(三)采用ERIC-PCR方法、多位点序列分型法(Multilocus sequence typing,MLST)和系统发育进化分型法(Clermont,2000)等三种方法对6种不同源大肠杆菌进行发育分型。结果表明,30株不同源代菌株分属于9个ERIC基因型,属于9个不同的克隆来源,其中8株(26.7%)同属于基因Ⅲ型,其次是7株(23.3%)、5株(16.7%)和4株(13.3%)分属于基因Ⅰ、基因Ⅵ和基因Ⅷ型。其中有2组非同源大肠杆菌(兔源R2B、人源H018.H029、H050和犬源Q7)和(犬源Q12和人源H032)属于1个克隆来源,ERIC-PCR图谱一致。MLST分类结果表明30株非同源大肠杆菌代表菌株共有17个ST型,与现有ST序列相比,其中距离比较近的是ST10.ST155.ST328,其余的则比较分散。本研究还发现有9个新型ST序列。非同源大肠杆菌(兔源R51a和猫源M50、人源H029和犬源Q7)具有同一ST类型。这两种发育分型揭示oqxAB基因的传播是不仅存在克隆传播,也有水平扩散等其他传播方式。结果显示MLST分型结果与ERIC-PCR分型结果比较一致。系统发育进化分型法对181株大肠杆菌的检测结果表明,38株属于D群,其中犬源5株(9.4%)、兔源3株(10.71%)、鸵鸟源3株(12.0%)、鸭源9株(40.9%)和人源18株(36%),猫源为0株；47株属于B2群,其中犬源14株(24.4%)、兔源0株(0%)、鸵鸟源13株(52.0%)、鸭源4株(18.2%)和人源16株(32%)；其余均属于A群和B1群,认为属于D群和B2群的菌株是致病性大肠杆菌,共占全菌株总数的46.96%。(四)采用供体菌和受体菌过夜共培养、双抗药物筛选和oqxAB基因验证等操作方法进行质粒接合试验,采用CLSI(2010)方法对接合子进行药物敏感性(MIC值)测定,判定接合子的耐药表型。另外,提取受试菌株的质粒组DNA,进行ECORI和XhoI双酶切或不酶切两种方法处理质粒DNA,电泳分离后转膜至尼龙膜,用依据DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ(Roche公司)指定方法标记好的探针进行Southern杂交、显色,以进行oqxAB基因的质粒定位。结果本试验成功了获得了8株大肠杆菌接合子,其中鸭源3株、其他源各1株,揭示出oqxAB位于可接合性质粒上,能够通过质粒进行水平转移或转导；接合子药物MIC值结果表明,68%的接合子介导了环丙沙星、氟本尼考、喹乙醇和及加替沙星的耐药转移。Southern杂交结果显示,猫源大肠杆菌M17、鸵鸟源大肠杆菌T1和兔源大肠杆菌R20,其oqxAB基因不仅存在>50-108kb的大小不同的质粒上,也位于细菌染色体上。而仅在犬源大肠杆菌Q1和人源大肠杆菌H029的染色体上发现了oqxAB主动外排泵基因,质粒上未发现。表明oqxAB基因既可位于质粒上,也可位于染色体上,也可同时位于细菌的染色体和质粒上。(五)利用PCR定位法,选择肠杆菌科多见的插入序列ISEcp1、IS26基因序列上游设计引物作为PCR定位的上游引物,针对oqxA基因序列设计引物作为下游引物,进行常见插入序列ISEcp1和IS26的检测和定位。结果6种非同源大肠杆菌中这两种插入序列广泛存在,ISEcp1的检出率分别为：鸭源大肠杆菌22.2%、鸵鸟源大肠杆菌80.3%、犬源大肠杆菌10.2%、兔源大肠杆菌75%和人源大肠杆菌16%；相应的IS26检出率依次为33.3%、88.0%、25.6%、58.5%,而猫源大肠杆菌中未检测到ISEcp1和IS26。同时选择代表菌株的ISEcp1、IS26测序、登录GenBank比对,获得4种类型连接插入序列的oqxAB基因环境,揭示了oqxAB基因可随同插入序列随转座子进行水平转移。另外本研究还通过长片断保真酶PCR扩增法,成功获得了6株非同源大肠杆菌的外排泵oqxAB的全基因序列,已分别提交GenBank获得登录号。其中鸵鸟源1株(T1)和人源1株(H050)上游连同插入序列IS26和ISEcp1序列一起提交至GenBank。