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目的:利用基因工程技术制备重组天花粉蛋白(rTCS)及具有反应活性的半胱氨酸的重组天花粉蛋白突变体(rTCS-N10-C)。分别用低分子量鱼精蛋白(Low Molecula Weight Protamine,LMWP)、聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)、牛血清白蛋白(Bovin Serum Albumin,BSA)修饰 rTCS-N10-C,制备了 rTCS-N10-SS-LMWP、rTCS-N10-PEG、rTCS-N10-BSA偶联物,并考察rTCS和这些偶联物的抗肿瘤活性。方法:根据已知的天花粉蛋白的碱基序列,构建rTCS质粒。利用蛋白重组技术在rTCS的C端插入一段特异序列,使其表达天冬酰胺内肽酶Legumain底物肽及具有反应活性的半胱氨酸的rTCS-N10-C。将质粒转入大肠杆菌进行原核表达,经Ni2+-NTA亲和层析树脂和肝素亲和色谱柱分离纯化rTCS和rTCS-N10-C。通过异双功能交联剂或聚合物的活性基团与rTCS-N10-C的游离巯基反应,分别合成rTCS-N10-SS-LMWP、rTCS-N10-PEG、rTCS-N10-BSA偶联物,并运用快速蛋白液相色谱(FPLC)进行纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行表征、BCA法测定蛋白含量,MTT法、流式细胞检测仪考察rTCS及其修饰物对肿瘤细胞增殖的抑制作用。结果:通过基因工程技术,成功制备了 rTCS和rTCS-N10-C。通过化学偶联方法,合成了 rTCS-N10-SS-LMWP、rTCS-N10-PEG 和 rTCS-N10-BSA 偶联物。体外活性研究结果显示,rTCS可显著诱导普通肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞发生早期凋亡,对它们的增殖具有一定的抑制作用;rTCS-N10-SS-LMWP的抗肿瘤活性明显强于rTCS;Legumain可以水解rTCS-N10-PEG的天冬酰胺的肽键;rTCS-N10-PEG对普通肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞均有显著的诱导早期凋亡的作用,但MTT实验显示其对肿瘤细胞的毒性作用不明显;rTCS-N10-BSA对体外培养的肿瘤细胞表现出浓度依赖性的抑制作用,体内实验显示rTCS具有较强的抑制肿瘤生长的作用,而rTCS-N10-BSA的体内抗肿瘤活性略低于rTCS。结论:rTCS具有较强的抗肿瘤活性,LMWP修饰可显著提高重组天花粉蛋白的抗肿瘤作用。利用现代化技术手段研究传统中草药是中药现代化的可行途径之一。