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目的:叶酸预防神经管畸形等人类出生缺陷的效果及机制的研究已成为热点。神经管是胚胎发育成脑、脊髓等中枢神经系统的原基,其细胞增殖、凋亡及细胞粘附等细胞生物学活动的平衡是神经管组织结构、细胞功能正常发生发育的基础。本课题观察大、中、小剂量叶酸干预时,胎鼠神经管细胞增殖与凋亡相关因子、粘附分子及孕鼠血清Hcy的表达变化,旨在探讨叶酸对神经管细胞增殖、凋亡及细胞粘附等生物活动的影响,为叶酸临床应用于预防神经管畸形等出生缺陷提供理论和实验依据。方法:1实验动物分组及叶酸干预:选取8~10周龄健康清洁级SD大鼠60只,雌性40只,雄性20只。雌性大鼠随机分为四组:空白对照组(F0)、小剂量叶酸组(F1)、中剂量叶酸组(F2)、大剂量叶酸组(F3),每组10只。雌雄大鼠按2:1合笼,次晨查阴栓阳性者确定为受孕,记为E0.5d。叶酸干预组自确定受孕之日起,分别灌服0.5mg/kg/d(小剂量组)、1.0mg/kg/d(中剂量组)、2.0mg/kg/d(大剂量组)的叶酸,连续10天。对照组灌服等容量的生理盐水。2取材及制片:各组孕鼠均于妊娠13.5天(E13.5d)处死取材,每只孕鼠随机取2只胎鼠头部,其中1只置于Bouin液中固定,用于制片;另一只置于液氮保存,用于Western-blot。标本固定后,常规脱水、包埋,切片,每隔10张取4张裱片,待染。经心腔所取的血液置于离心管中离心获取血清。3一般组织学技术:切好的标本行HE染色,光学显微镜下观察各组神经管组织结构及细胞形态的发育状态及变化。4免疫细胞化学技术:采用免疫细胞化学法显示各叶酸干预组和空白对照组胎鼠神经管细胞中PCNA、Bax、Bcl-2阳性细胞,应用Mivnt显微图像分析仪分析阳性细胞的平均光密度值,说明PCNA、Bax及Bcl-2表达的情况。5采用蛋白印迹(Western-blot)技术检测各实验组胎鼠神经管细胞中NCAM的表达情况。6应用固相酶联免疫(ELISA)技术检测各叶酸干预组与空白对照组妊娠大鼠血清Hcy水平及变化。7应用SPSS17.0统计学软件进行数据处理,采用单因素方差分析和q检验,p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1一般组织形态学结果对照组13.5d胚胎大鼠神经管已经形成,神经管上皮为较厚的假复层柱状,细胞排列紧密。套层细胞排列较稀疏,可见边缘层,其内细胞很少。间充质细胞数量较多,分布均匀。各剂量叶酸组胎鼠神经管细胞类型、细胞形态、组织结构与对照组比较未见明显改变。2免疫细胞化学结果2.1 PCNA的表达PCNA在各组神经管细胞均可见表达,棕黄色颗粒状阳性物分布于细胞核内。总体分析显示,叶酸干预组神经管细胞中PCNA的平均光密度(MOD)值明显高于对照组(P<0.01),叶酸提高了PCNA的阳性表达,提示叶酸具有促进神经管细胞增殖的作用。叶酸不同剂量组间比较,大、中剂量组PCNA表达均高于小剂量组(P<0.05);大剂量组PCNA的表达高于中剂量组,但无明显差别(P>0.05)。说明剂量的不同使叶酸对胎鼠神经管细胞促进增殖作用出现差异,在一定范围内其增殖效应与剂量有关。2.2 Bax的表达Bax在各组神经管细胞均可见表达,阳性物质呈棕色或黄色颗粒状,分布于细胞浆内。总体分析显示,叶酸干预组神经管细胞Bax的平均光密度显著低于对照组(P<0.01),Bax的表达降低,提示叶酸具有抑制神经管细胞凋亡的作用。不同剂量叶酸组间比较,大、中剂量叶酸组Bax的表达明显低于小剂量叶酸组(P<0.05);大剂量叶酸组Bax的表达低于中剂量叶酸组,但无明显差异(P>0.05),说明叶酸剂量的不同影响了Bax的阳性表达,不同剂量叶酸下调Bax表达量的程度不同,在一定范围内其抑制作用与剂量有关。2.3 Bcl-2的表达Bcl-2在各组神经管细胞均可见表达。阳性物质呈棕色或黄色颗粒状,大部分位于细胞浆内。总体分析显示,叶酸干预组神经管细胞Bcl-2的平均光密度明显高于对照组(P<0.01),提示叶酸上调Bcl-2的表达,增强其抑制细胞凋亡的作用。不同剂量叶酸组间比较,大、中剂量叶酸组Bcl-2表达均显著高于小剂量叶酸组(P<0.05);大剂量组低于中剂量组,但无明显差异(P>0.05)。不同剂量叶酸组Bcl-2表达量的差别,提示剂量可影响叶酸调节神经管细胞凋亡的作用,在一定范围内其调节凋亡程度与剂量有关。3 NCAM的表达Western-Blot检测结果:各剂量叶酸干预组NCAM的表达比对照组显著减少(P<0.01)。说明叶酸可降低NCAM表达。组间比较,大、中剂量组NCAM表达均显著低于小剂量叶酸组(P<0.05);大剂量组与中剂量组比较NCAM有所减少,但差异无统计学意义(P>0.05)。提示一定范围内叶酸剂量能影响了NCAM的表达。4孕鼠Hcy检测结果Hcy水平按对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量叶酸干预组顺序呈逐渐下降趋势。单因素方差总体分析显示,叶酸干预组孕鼠Hcy水平明显低于对照组(P<0.01),说明叶酸具有降低Hcy水平,减弱致神经管畸形危险因素的作用。不同剂量组间比较,大、中剂量组Hcy水平均明显低于小剂量叶酸组(P<0.05);大剂量叶酸组与中剂量叶酸组之间比较无明显差别(P>0.05)。说明不同剂量的叶酸对Hcy水平的影响不同,在一定范围内其效应与剂量有关。结论:1给予受孕大鼠大、中、小剂量叶酸时,胎鼠神经管的正常组织结构与细胞形态的生长、发育无明显改变。2大、中、小剂量叶酸干预能提高胎鼠神经管细胞PCNA的表达,叶酸具有促进胎鼠神经管细胞增殖的作用。不同剂量的叶酸对胎鼠神经管细胞增殖影响程度不同,一定范围内其促增殖效应与剂量有关。3妊娠大鼠服用大、中、小剂量叶酸可降低促凋亡因子Bax在胎鼠神经管细胞的表达,不同剂量叶酸下调Bax表达的作用程度不同,在一定范围内与剂量有明显关联。4给予孕鼠大、中、小剂量叶酸可提高胎鼠神经管细胞凋亡抑制因子Bcl-2的表达,不同剂量叶酸增强Bcl-2表达的作用程度不同,一定范围内增强效应与剂量有关。5孕鼠灌服大、中、小剂量叶酸可降低胎鼠神经管细胞NCAM的表达,拮抗NCAM抑制细胞增殖的作用。不同剂量叶酸降低NCAM表达作用程度不同,在一定范围内与剂量有明显关联。6叶酸干预能明显降低妊娠大鼠血清Hcy水平,弱化致神经管畸形的危险因素。不同剂量的叶酸致Hcy水平降低作用程度不同。一定范围内其弱化作用与剂量有关联。7综上所述,叶酸干预具有促进胎鼠神经管细胞增殖的作用。叶酸可能通过影响细胞凋亡正负向调节因子Bcl-2和Bax的表达,调节神经管的细胞凋亡活动。叶酸还通过降低血清Hcy水平和神经管NCAM的表达,促进神经管的发育。一定剂量叶酸对神经管的细胞增殖与凋亡平衡及组织结构发育起到有益作用。