来源于嗜盐古生菌的RM07 DNA片段在三域模式生物中的启动子功能研究

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利用大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8,从极端嗜盐古生菌的基因组DNA中分离得到一个在大肠杆菌中具有启动子活性的RM07 DNA片段,DNA序列分析表明它既含有典型的真细菌启动子-35区和-10区保守序列,又具有嗜盐古生菌启动子特征序列DPE(distal promoter element)。 在嗜盐古生菌、大肠杆菌和酿酒酵母中分别以β-半乳糖苷酶基因(bgaH)、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)、氯霉素抗性基因(cat)、G418抗性基因(neo)为报告基因,通过构建各种RM07片段和报告基因相融合的重组质粒、酶活测定、抗性水平检测以及逆转录PCR(RT-PCR)检测报告基因转录等方法,研究了RM07 DNA片段的启动子功能,结果证明RM07片段在三域模式生物——古生菌(嗜盐古生菌)、真细菌(大肠杆菌)和真核生物(酵母菌)中均具有启动子活性,能够驱动不同报告基因的转录和表达。 在嗜盐古生菌、大肠杆菌和酵母菌中分别对RM07片段进行了启动子缺失突变分析,构建了一系列RM07不同缺失片段插入报告基因上游的重组质粒,检测了RM07不同缺失片段的启动子活性大小,在三域模式生物中分别浓缩定位了RM07片段中对于启动子活性有影响的重要功能区。结果表明:含有-35区和-10区特征序列的40bp区段是RM07片段在大肠杆菌中具有基础启动子活性的重要功能区;嗜盐古生菌启动子特征序列DPE对于RM07片段在嗜盐古生菌和酵母菌中的启动子活性都是必需的功能元件;RM07片段中的-35区、-10区特征序列和嗜盐古生菌启动子特征序列DPE在启动子功能上具有一定的相关性。 在大肠杆菌中对RM07片段进行了定点诱变分析,结果表明不同碱基突变对RM07片段的启动子活性产生不同的影响,从而进一步精确定位了R材07片段中对在大肠杆菌中的启动子功能有重要作用的关键碱基,初步鉴定了可能的转录起始位点,并且通过改造RM07片段的碱基组成成份大幅提高了其在大肠杆菌中的启动子活性。 本研究还成功地将热化学研究的重要方法—微量量热技术应用于启动子的结构与功能研究,进一步证实了RM07片段在大肠杆菌中的启动子功能,获得了不同的碱基突变影响RM07片段在大肠杆菌中的启动子活性的精确数据,热化学研究结果与生物学的研究结果基本一致。本研究也为启动子功能的研究提供了一种新的更加灵敏便捷的化学与生物学相结合的方法。
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