目的:唇腭裂是一种常见的先天性畸形,其发生率约为1‰~4‰,我国为1.84‰。疾病分型包括单纯性唇裂、单纯性腭裂和唇腭裂;而根据其是否伴有其他组织结构的异常,可划分为综合征型唇腭裂(syndromic cleft lip with or without cleft palate,SCL/P)和非综合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with orwithout cleft palate,NSCL/P),二者分别占唇腭裂总数的30%和70%。唇腭裂病因尚不清楚,是环境因素和遗传因素相互作用的复杂多基因疾病。若能找到该病的致病位点或易感基因,对于研究其发生机制和胚胎早期诊断、干预都具有十分重要的意义。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,DNA甲基化在大多数情况下可以抑制基因的表达,反之去甲基化则可以使基因重新活化和表达。目前,DNA甲基化检测技术有中低通量的BSP(Bisulfite Sequencing PCR)和MSP(Methylation-Specific PCR)、中高通量的MethyLight和高通量的全基因组甲基化分析(ChIP on chip)。本课题我们利用甲基化芯片技术筛查单纯性唇裂(NSCL)胎儿局部病变组织的异常甲基化位点,并利用焦磷酸测序技术进行大样本验证初步确定候选基因,最后在大鼠成肌细胞系中进行候选基因的功能鉴定,期望能找出单纯性唇裂的相关基因,为今后的产前诊断提供依据。研究方法:1、标本收集。(1)NSCL组:2012年12月之前于中国医科大学附属盛京医院产前诊断中心诊断为NSCL的引产胎儿病变组织,共16例。孕周为22-30周。(2)正常对照组:选取周龄与NSCL组相匹配的非唇腭裂引产胎儿唇部组织,共15例。2、甲基化芯片技术筛查NSCL组织异常甲基化位点。选择周龄相匹配的NSCL组和对照组胎儿各3例(女性胎儿2例,男性胎儿1例),取唇部组织提取DNA,进行甲基化芯片检测。本实验中采用的是Illumina公司的450K Infinium Methylation BeadChip芯片。3、甲基化芯片结果生物信息学分析。应用MINI-R软件、GO注释、Pathway代谢通路注释、多样品间表达模式聚类分析等生物信息学方法对差异位点和基因进行功能分析。4、Real-time PCR对候选基因在组织标本中的表达差异分析。由于甲基化芯片结果筛选出大量甲基化异常位点,我们从二个标准确定候选基因:(1)以往文献报道和唇腭裂发生相关的基因,同时在本实验芯片结果中患者组存在异常高甲基化水平的位点,并且统计分析显示有较强显著差异(p<0.05|beta.difference|>0.14))的;(2)芯片结果甲基化水平差异的基因中,参与重要细胞通路的转录因子。在本实验中,我们先采用Real-time PCR的方法扩大样本量对这上述标准筛选出的候选基因在16例患者组和15例对照组中的表达情况进行检测。5、焦磷酸测序技术对候选基因异常甲基化位点的验证。对于芯片结果甲基化水平异常且Real-time PCR验证表达下调的的基因相关位点,设计引物,提取DNA,用甲基化转化试剂盒进行转化、纯化。以转化后的DNA样本做模板,进行PCR。取10μl PCR产物上PyroMark Q96实时定量焦磷酸系列分析仪,导出实验结果并分析。6、Western Blot和免疫组化技术检测候选基因在患者与正常对照组中的表达。取患者组织16例和对照组15例,采用Western Blot方法验证候选基因在患者组和对照组之间的蛋白表达差异。同时将其余组织固定用于免疫组化染色,检测候选基因在病变组织中的表达。7、大鼠成肌细胞中候选基因的功能研究。利用siRNA-脂质体3000转染大鼠成肌细胞系,干扰Dab1基因的表达,然后利用Real-time PCR、Western Blot检测转染后12h、24h不同时间RNA、蛋白表达情况,确定对Dab1基因沉默的效率。利用细胞划痕实验、Transwell方法检测Dab1基因沉默后细胞迁移能力的改变,利用流式细胞仪检测细胞凋亡的改变,利用MTT法检测细胞增殖率的改变。结果:1、甲基化芯片对病变组织标本中甲基化差异位点的筛选。(1)NSCL胎儿的病变组织与正常对照组织相比存在大量的甲基化异常位点,其中高甲基化位点3661个,低甲基化位点1218个。这些甲基化异常位点存在于2849个基因之中,在除了Y染色体以外的各条染色体上均有分布。众多的异常高甲基化位点所在基因参与了重要生物学功能,可能导致了一部分相关基因的表达异常,从而直接或者间接影响了胚胎发育过程中颅面部的形成。从位点分布的位置来看,在筛选出来的甲基化水平差异位点中,分布于基因本体区、CpG岛的位点占很大比例,另外也有一些在TSS1500区域和岛前区域。(2)在已有研究报道和唇腭裂发病相关的基因中,结合我们的芯片结果,显示有异常高甲基化水平(p<0.05)的基因有MSX1、BMP7、EGFR、PAX9、GLI2、IRF6。(3)通过检索Pathway的主要公共数据库分析差异基因参与的主要信号转导通路中,REELIN细胞通路中的二个关键转录因子(DAB1和FYN)在患者组均存在高甲基化的位点;鉴于REELIN为该通路的主要成员,因此在后续研究中我们同时将REELIN与DAB1、FYN同时列为研究对象。2、Real-time PCR检测候选基因mRNA在病变组织中表达情况。利用Real-time PCR的方法对9个候选基因在病变组织中的表达情况进行检测,标本来源为16例患者组和15例对照组。结果表明DAB1、FYN、REELIN基因在NSCL胎儿病变组织中的表达情况与对照组相比,患者组表达下调且有显著差异(p<0.05);MSX1、GLI2、IRF6基因表达上调,有显著差异(p<0.05);BMP7、EGFR、PAX9则没有显著差异。3、扩大样本量焦磷酸测序验证芯片结果。我们对Real-time PCR结果中显示表达显著下调的两个基因(DAB1和FYN)的甲基化异常相关位点,进行了焦磷酸测序验证,标本来源为16例患者组和15例对照组。结果显示位于DAB1基因体区CpG岛的二个cg位点甲基化水平存在显著差异(P<0.05);相关性分析结果表明:这二个位点中的一个cg位点,其甲基化程度与DAB1基因的表达水平呈负相关(P<0.01,r=-0.6076)。即患者组存在高甲基化现象,并且基因表达量在组织中下调,而FYN的相关位点的甲基化水平差异并没有统计学意义。4、Western Blot和免疫组化检测候选基因的蛋白表达情况。应用Western Blot和免疫组化的方法对病变组织中的DAB1和FYN蛋白表达进行检测,结果发现在患者组织中两个蛋白表达量均显著降低(P<0.001)。5、大鼠成肌细胞中Dab1基因沉默效率检测。利用Real-time PCR和Western Blot对大鼠成肌细胞系进行Dab1基因siRNA沉默12h、24h、48h后进行RNA、蛋白表达水平检测,结果显示转染后24h mRNA表达水平最低,48h蛋白表达量最低。6、大鼠成肌细胞Dab1基因沉默后细胞迁移能力、凋亡、增殖情况的检测。细胞划痕实验、Transwell迁移实验结果均提示Dab1基因被沉默后,细胞的迁移水平被抑制;流式细胞仪检测凋亡,结果表明凋亡水平没有明显改变;MTT法检测细胞增殖率结果表明,增殖率也没有差别。所以提示Dab1基因表达水平的抑制,影响了局部细胞的迁移能力,从而导致了面部形成过程中组织的融合异常。结论:1、NSCL胎儿的病变组织存在大量的甲基化异常位点,在除Y染色体以外的各条染色体上均有分布。甲基化异常位点主要分布于基因本体区和CpG岛,少部分分布在TSS1500区域和岛前区域。2、REELIN信号通路基因表达异常与NSCL发生有关。3、NSCL胎儿的病变组织中DAB1基因异常的高甲基化导致DAB1低表达是NSCL病理改变发生的原因之一。4、siRNA干扰大鼠成肌细胞中Dab1基因的表达,可引起细胞的迁移能力明显降低,但对凋亡、增殖方面没有影响。