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前言:家族性乳腺癌指的是两个同一家族成员患有乳腺癌的情况。而具有明确遗传因子的乳腺癌则被称为遗传性乳腺癌,占乳腺癌人群的5-10%。大多数遗传性乳腺癌与BRCA1和BRCA2有关。除BRCA1/2外,还有其他已知的乳腺癌易感基因,如p53、PTEN、ESR1、FGFR2和TOX3等,与这些基因突变相关的乳腺癌被归类为遗传性乳腺癌[1,2,3]。范可尼贫血（FA）是一种累及造血干细胞的常染色体隐性遗传性疾病,临床表现复杂多样。基因分型发现其至少有19个亚型（FANCA,FANCB,FANCC,FANCD1,FANCD2,FANCE,FANCF,FANCG,FANCI,FANCJ,FANCL,FANCM,FANCN,FANCO,FANCP,FANC,FANCQ,FANCR,FANCS和FANCT,其中至少12个基因已被克隆,这些基因可以解释差不多所有的FA病例[4,5]。目前的研究发现,由FA基因编码的蛋白质可以相互协调,通过“FANCONI贫血/BRCA途径”调节DNA损伤修复[6,7]。FANCD2与BRCA1是FANCONI贫血/BRCA通路中重要的组成成分。DNA突变是人类许多肿瘤疾病的主要原因。其直接原因主要是由不同类型的DNA损伤引起的,而不同因素引起的DNA损伤可以通过不同的修复途径进行修复[8,9]。DNA修复中的遗传缺陷也是许多遗传性疾病的分子基础,这些患者通常具备极高的肿瘤易感性[10]。有研究发现,乳腺癌相关的致癌基因BRCA1/2可与其他肿瘤抑制基因（如FA基因）形成复合物,通过同源染色体重组的方式调节基因修复以防止肿瘤发生[11,12]。目的:了解BRCA1与FANCD2基因在家族性、散发性乳腺癌及良性组织中表达情况及研究两者是否具有相关性。探讨两种基因在FA/BRCA通路中的作用。研究FANCD2的泛素化在散发性乳腺癌中的情况,探讨FANCD2泛素化在疾病进展过程中的作用。对所有恶性病例进行随访,分析伴有BRCA1、FANCD2基因表达和Fancd2泛素化差异的乳腺癌患者的病理学特点及愈后情况有何不同。材料与方法:采用免疫组化SP法检测家族性、散发性乳腺癌及乳腺癌良性增生共计335例蜡块组织中BRCA1及FANCD2蛋白的表达,研究BRCA1及FANCD2在不同组织中的表达情况。采用Western Blot技术检测56例散发性乳腺癌中FANCD2的蛋白水平及泛素化程度。收集所有乳腺癌病人的临床病理资料并随访病人的预后情况,分析BRCA1和FANCD2的表达,以及FANCD2的泛素化程度与家族性和散发性乳腺癌预后的关系,并结合TCGA数据库验证本次实验结果。结果:1、病例特征良性肿瘤组共47名女性,中位年龄46岁（18-71岁）,病理结果包括纤维腺瘤（15例）,囊性增生（24例）,导管内乳头状瘤（7例）,和硬化性腺病（1例）。288名原发性乳腺癌患者（表1）,家族组组诊断中位年龄为52岁（31-76岁）,散发组为50岁（25-79岁）。其中包括导管内癌（39例）,浸润性导管癌（172例）,浸润性小叶癌（47例）和其他罕见类型（30例）。组织学类型主要是I型（家族组:30.5%,散发组:21.1%）和II型（家族组:47.5%,散发组:53.1%）。大部分肿瘤T分期是T1（46.9%）和T2（43.1%）,腋窝淋巴结转移率（41%）。根据2017年AJCC标准,大多数患者TNM分期为I期（家族组:43.3%,散发组:37.4%）或II期（家族组:36.2%,散发组:38.1%）。随访时间于2016年1月终止,中位随访时间为74.4个月（4-155个月）。中位DFS时间为91.8个月,1年,3年和5年DFS率分别为97.9%,91.7%和83.3%。在5年内发生了24例（8.33%）局部复发和29例（10.08%）远处转移。2、BRCA1和FANCD2的免疫组织化学染色1）BRCA1在良恶性乳腺组织中的表达多位于细胞质和细胞核中。FANCD2的典型染色结果在良恶性组织中主要是细胞核（图1）。表2显示了患者的临床特征和BRCA1和FANCD2的表达的相关性。家族组中BRCA1的表达与肿瘤大小（P=0.021）,淋巴结转移（P=0.004）,TNM分期（P=0.01）,ER（P=0.014）和FANCD2表达（P<0.001）呈正相关。然而,在散发组病例中未发现这些相关性。而散发组中FANCD2的表达与肿瘤大小（P=0.003）,TNM分期（P<0.001）和Ki-67指数（P=0.015）呈正相关。良性组织BRCA1（29/47,61.7%）和FANCD2（21/47,44.7%）多为阳性表达,而两种蛋白的表达没有相关性（P=0.206）。良性组织BRCA1阳性率高于SBC组织（61.7%对14.3%,P<0.001）,FANCD2阳性率高于SBC组织（44.7%对27.9%,P=0.069）。2)基于TCGA数据进一步分析及验证乳腺癌中BRCA1和FANCD2的表达。本实验的免疫组织化学显示BRCA1和FANCD2在乳腺癌组织和邻近组织中均表达。基于GEPIA的结果,BRCA1和FANCD2在乳腺癌组织中的表达均高于癌旁组织中的表达（图2）。我们使用TCGA数据集分析FANCD2和BRCA1的表达临床参数之间的关联。共计入组1080病例,由于入组要求不同,我们的结果与TCGA数据库验证的结果不完全相同（表3）。BRCA1和FANCD2在TCGA数据集中的表达与肿瘤大小（BRCA1:P<0.001;FANCD2:P<0.001）和ER表达（BRCA1:P<0.001;FANCD2:P<0.001）呈正相关,此外BRCA1和FANCD2表达之间存在正相关。FANCD2在TCGA数据集中的表达与TNM分期呈正相关（P=0.039）。TCGA数据库的上述结果与本研究的结果一致。3、BRCA1和FANCD2表达的预后价值根据家族组及散发组患者的BRCA1和FANCD2表达状态进行Kaplan-Meier生存分析研究。在家族组中,与BRCA1阴性（5年DFS率95.2%,中位无病生存时间108.8月）相比,BRCA1阳性者（5年DFS率77.8%,中位无病生存时间81.4月）预后较差（P=0.001,图3A）。然而,在家族组中,FANCD2阳性者组具有较低的5年DFS（78%vs 86.6%）和较短的DFS中位时间（79.7个月对96.7个月）。但FANCD2阳性与阴性者预后没有统计学差异（P=0.328,图3B）。散发组中,尽管BRCA1阳性组具有较低的5年DFS率（76.2%对84.9%）和较短的无病生存时间（92个月对94.3个月）,但统计学上并无明显差别（P=0.22,图3C）。在散发组中,FANCD2阳性者预后较差（P<0.001,图3D）,5年DFS率（63.4%对91.5%）和无病生存时间（69.7个月vs 103.3个月）均低于阴性者。因此,我们得出结论BRCA1表达在家族组病例中具有显著的预后价值,而FANCD2表达在散发组病例中具有显著的预后价值。4、乳腺癌患者的单因素和多因素分析单因素分析显示,家族组患者的5年DFS率与TNM分期（P=0.001）和BRCA1表达（P=0.001）显著相关,而散发组患者的DFS率与肿瘤大小（P=0.001）,淋巴结转移（P=0.004）,TNM分期（P<0.001）,Ki-67表达（P=0.025）和FANCD2表达（P<0.001）有相关性。多变量Cox分析还显示,TNM分期（III-IV与I-II,HR:2.042,95%CI:1.150-3.624,P=0.015）和BRCA1表达（阳性与阴性,HR:2.168,95%CI:1.142-4.113,P=0.018）是家族性乳腺癌预后的独立因素。在散发组中,TNM分期（III-IV与I-II,HR:4.361,95%CI:2.465-7.716,P<0.001）和FANCD2表达（阳性与阴性,HR:1.192,95%CI:1.041-3.512,P=0.037）是预后的独立因素（表4）。5、FANCD2泛素化是SBC的独立预后因素FANCD2的泛素化反映了FA途径的功能性激活,并且我们的研究中FANCD2表达是SBC的独立预后因子。因此,我们对56个随机选择的SBC组织进行Western印迹检测,以探讨FANCD2泛素化是否与预后相关。我们用FANCD2-L和FANCD2-S的表达强度比值（L/S比值）（图4）以量化FANCD2泛素化水平,L/S比率范围为0.13至1.36（中位数:0.645）。随后将56例患者根据中位数分为高泛素化组（Ub High,≥0.645）和低泛素化低（Ub Low,<0.645）,部分Western印迹结果如图5（16,17）所示。通过随访我们发现Ub High患者的5年DFS率显著优于Ub Low患者（P=0.036,图6）,单因素和多因素分析的结果见表5.在FBC病例中,Ub High患者有更好的5年无病生存率（85.7%对71.4%）和更长的中位生存时间（101.2个月对73.4个月）。多变量分析显示,除TNM分期（P=0.003）和FANCD2表达（P=0.006）外,FANCD2泛素化水平也是散发性乳腺癌患者的独立预后因素（Ub High vs.Ub Low,HR:0.335,95%CI:0.128-0.875）,P=0.026)。结论:1、BRCA1和FANCD2在乳腺癌中存在正相关。乳腺癌的发生和发展与FANCD2的表达和FA/BRCA途径的失活有关。BRCA1的突变可通过激活FANCD2表达来影响乳腺癌的发生发展,FANCD2也可能通过FA/BRCA途径影响乳腺癌的形成。2、家族性乳腺癌中BRCA1阳性者预后更差,而FANCD2的表达与预后的关系不确切。3、散发性乳腺癌中高FANCD2表达和低FANCD2泛素化预示着相对较差的预后。FANCD2泛素化的过程受到了抑制。有报道这可能达与泛素化连接酶的活性异常有关,也有可能与FA/BRCA通路的上游功能异常,导致下游FANCD2的泛素化受影响,最终影响整个通路发挥作用,导致恶性肿瘤的出现。4、在乳腺癌中,肿瘤大小,淋巴结浸润情况,TNM分期,ER,BRCA1表达情况是显著的预后因素。而在散发性乳腺癌中FANCD2表达及泛素化程度也可作为评价预后的独立因素。