一、海洋新型噬菌体MfV的发现海洋中病毒数量丰富,且其丰度占全部生物体丰度的94%之多。但相比于海洋中的细菌来说,人们对于病毒的多样性、宿主范围和在海洋生态系统中所发挥的作用等知之甚少。虽然通过宏基因组测序能够得到很多海洋病毒的基因组序列,但其中的大部分病毒还未被分离和培养得到,对于它们的结构和性质也无从研究。因此,分离、培养和鉴定海洋中的新型病毒并对其性质进行研究,对于拓宽人们对海洋病毒的认识和了解病毒在海洋生态系统中发挥的作用具有重要意义。海洋病毒中数量最多的是噬菌体,它们在裂解细菌、促进细菌间基因水平转移和加速生物地球化学循环等方面发挥着重要的作用。根据对海洋中病毒形态进行观察和宏基因组测序的结果,海洋中的双链DNA无尾噬菌体数量丰富且分布广泛。但目前分离得到的海洋双链DNA无尾噬菌体只有Corticoviridae科噬菌体Pseudoalteromonas virus PM2（简称 PM2）和 Autolykiviridae 科噬菌体。本部分对一株来源于青岛近海的海单胞菌属细菌MarinomonasfoliarumJZW（简称菌株JZW）及其噬菌体MfV进行了研究,包括对菌株JZW进行了培养与鉴定,对MfV进行了分离、培养、纯化和基因组学鉴定,探究了 MfV的基本生物学特性,并发现了 MfV能诱导细菌产生大量囊泡的性质。（1）菌株JZW的培养与鉴定来源于青岛近海的菌株JZW的形态为弯曲的杆状,长约1.5-2 μm,宽约400-550 nm,具有单极鞭毛。菌株JZW在25℃摇床180 rpm培养2.5 h时达到对数生长中期,这为后续的噬菌体培养提供了支持。对菌株JZW的16S rRNA基因序列进行测定和分析后,发现其基因序列与海单胞菌属细菌M.foliarum IVIA-Po-155T的相似性达到99.57%。在系统发育学分析中,菌株JZW被归类到海单胞菌属,因此将其命名为M.foliarum JZW。菌株JZW的基因组大小为3935353 bp,含有2个不完整的前噬菌体序列,但该序列不会从细菌基因组中释放出来,不会对后续实验中噬菌体的研究产生干扰。（2）噬菌体MfV的培养、纯化与鉴定经双层平板纯化后,得到了一株能够侵染菌株JZW的噬菌体MfV。对MfV侵染菌株JZW后产生的裂解液进行离心、过滤、切向流超滤浓缩和碘克沙醇密度梯度超速离心后,得到了纯度较高的MfV颗粒。MfV在碘克沙醇中的浮力密度（1.14 g/ml）与囊泡一致,低于其他海洋噬菌体的浮力密度。在透射电镜下对纯化的MfV进行观察,未看到尾巴结构且均为囊泡状结构,说明MfV为无尾噬菌体且其结构可能与囊泡类似。MfV的基因组为双链、环状、超螺旋DNA,大小为10075 bp,G+C含量为46%。MfV的完整基因组分两段存在于菌株JZW的基因组中,因此MfV是前噬菌体。MfV基因组中共含有20个开放阅读框（open reading frame,ORF）。根据蛋白序列比对和注释的结果,ORF5编码裂解酶,ORF6和ORF7编码尾巴蛋白,ORF12编码衣壳蛋白,ORF14编码ATPase,ORF18编码复制起始蛋白。MfV的衣壳蛋白与噬菌体PM2的衣壳蛋白P2最为相似,但同源性仅为11%。根据以衣壳蛋白、ATPase和复制起始蛋白的氨基酸序列构建的系统发育树可知,MfV与Corticoviridae科噬菌体PM2和Autolykiviridae科的代表性噬菌体1.008.O的进化关系最为相近。但是,MfV在衣壳蛋白、ATPase和复制起始蛋白上与噬菌体PM2和噬菌体1.008.O的相似性较低,且在系统发育树上的分支相对独立。另外,MfV基因组与PM2和1.008.O基因组的共线性较差,并且MfV基因组中含有尾巴蛋白基因和裂解酶基因,这与PM2和1.008.O是不同的,说明MfV有着自己独特的结构和侵染方式。这些结果说明MfV代表着噬菌体的一个新科,我们将其命名为Darkmattiviridae。这是继Corticoviridae和Autolykiviridae噬菌体之后发现的第三类海洋双链DNA无尾噬菌体,也是首次发现的能够侵染海单胞菌属细菌的无尾噬菌体。分析与MfV基因组相似的序列在水环境中的分布后发现,Darkmattiviridae科噬菌体在水环境中数量丰富且分布广泛,说明其对海洋生态环境具有重要的影响。（3）噬菌体MfV的基本生物学性质对噬菌体MfV的基本生物学性质进行研究表明,MfV具有以下不同于其他噬菌体的性质:a,MfV会吸附于宿主菌上。裂解液经过滤和离心后,MfV滴度明显减少,基因组难以被提取得到。b,MfV至少能够侵染2个属、7个种的43株菌,拥有广泛的宿主范围。c,MfV对表面活性剂十分敏感,低浓度的氯仿会使MfV完全失活。MfV对温和表面活性剂Triton X-100的敏感性明显高于与其系统发育最接近的噬菌体PM2。d,蛋白酶K的处理对MfV活性几乎没有影响,但会造成噬菌体PM2活性的完全丧失。e,MfV非常不稳定,易失去活性,在短时间内存活率下降比噬菌体PM2更快。因此,在海洋噬菌体的分离及噬菌体基因组学研究时,人们很容易将类MfV噬菌体即Darkmattioviridae科噬菌体忽略。这也可能是目前海洋中分离得到双链DNA无尾噬菌体较少的原因之一。以上的特性也反映了 MfV可能具有不完整的衣壳结构。（4）噬菌体MfV对宿主菌囊泡产生的诱导在透射电镜下可以看到,菌株JZW被噬菌体MfV侵染后发生了囊泡的大量释放。对囊泡进行纯化、观察并计数后发现:3种海洋有尾噬菌体侵染其宿主菌后的囊泡数量是未加噬菌体的对照组的6.25-8.72倍;PM2侵染其宿主菌后的囊泡数量是对照组的5.33倍;MfV侵染其宿主菌后的囊泡数量是对照组的43.63-65.52倍（体现在数量级上可达到2个数量级的变化）。因此,噬菌体MfV的侵染能够使宿主菌产生大量的囊泡,这是一种新的细菌囊泡产生途径。对被MfV侵染后的宿主菌所产囊泡中的DNA进行绝对定量qPCR和测序,结果显示由基因组数量反映的噬菌体数量在囊泡总数量中比例较高,且囊泡能够特定地包裹大量MfV的DNA。因此,被MfV侵染后宿主菌所产的囊泡中存在着大量的MfV颗粒,这为MfV具有不完整的外壳提供了重要依据。总的来说,我们发现了一种新的、可能不具有完整外壳的海洋双链DNA无尾噬菌体MfV,并且其代表噬菌体的一个新科Darkmattiviridae。这种噬菌体在海洋中分布广泛,能够诱导细菌产生大量囊泡,在海洋细菌-噬菌体的联系和海洋物质循环中发挥着重要的作用。同时,MfV的发现为无尾病毒在海洋中数量丰富且广泛分布提供了新的证据。二、海洋细菌Polaribacter sp.SM1127胞外多糖的应用潜力评价海洋中的微生物种类繁多,分布非常广泛,甚至极端海洋生境下也有很多微生物存在。很多海洋微生物都能分泌胞外多糖,并且这些胞外多糖大多具有独特的结构和性质,在不同的领域具有应用潜力。北极海湾低温、高盐、有明显的季节性变化,生活着一些极端微生物,如嗜冷菌、嗜盐菌和耐压菌等。它们所分泌的胞外多糖具有特殊的结构和性质,存在着重要的应用价值。Polaribacter sp.SM1127是一株从北极海湾的海带中分离得到的细菌。之前的研究发现,其所分泌的胞外多糖（简称SM1127胞外多糖）具有良好的保湿性和抗氧化活性,无口服毒性和皮肤刺激性,并在低温条件下对人皮肤细胞有较好的保护作用。鉴于这些优良性能的存在,本部分对SM1127胞外多糖的应用潜力做了进一步探究。（1）SM1127胞外多糖对受UVB辐射的人真皮成纤维细胞的保护作用在UVB辐射下,SM1127胞外多糖的存在能够增强人真皮成纤维细胞的活性和完整性。并且,SM1127胞外多糖能够减少细胞内的活性氧含量,增加细胞内的谷胱甘肽含量,提高细胞内的超氧化物歧化酶活性,从而降低细胞内的氧化水平,减小UVB辐射导致的氧化损伤。研究结果首次表明海洋微生物胞外多糖能够在UVB辐射下保护人皮肤细胞。（2）SM1127胞外多糖对大鼠皮肤的创伤修复和冻伤保护作用在大鼠背部全层皮肤创伤实验中,SM1127胞外多糖处理可提高伤口愈合率,促进皮肤组织修复。在大鼠背部全层皮肤冻伤实验中,SM1127胞外多糖预处理能减轻冻伤皮肤的炎症反应,从而使冻伤皮肤的伤口愈合率和组织修复速度高于对照组。研究结果首次表明微生物胞外多糖能够促进动物皮肤创伤修复和减小冻伤伤害。以上结果表明,SM1127胞外多糖在医药领域可能具有良好的应用潜力,这为其应用开发奠定了基础。