炎症性肠病（Inflammatory bowel diseases,IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）,是一组以胃肠道慢性、复发性、缓解性或进行性炎症为特征的疾病。流行病学统计结果表明,在过去的几十年里,IBD在北美和欧洲国家较为常见。但是,近年来,IBD在亚洲等发展中国家的发病率和患病率呈逐年上升趋势。虽然IBD明确病因尚不清楚,但临床和基础研究结果表明,此病的发病机制涉及黏膜免疫系统失调、促炎细胞因子水平升高和肠上皮屏障功能障碍等。巨噬细胞是结肠中最丰富的免疫细胞之一,其在维持黏膜免疫稳态和肠上皮屏障功能方面至关重要,并且参与IBD的病理过程。肠道巨噬细胞是肠道免疫稳态和肠道微生物群炎症反应的关键调节因子。巨噬细胞对炎症状态有重要影响,具有促炎和抗炎作用。根据局部微环境的不同刺激,巨噬细胞极化成两种表型和功能,即促炎型（M1型）巨噬细胞和抗炎型（M2型）巨噬细胞。M1型巨噬细胞产生大量的可诱发炎症的因子;而M2型巨噬细胞通过释放白细胞介素-4（interleukin,IL-4）和IL-10等因子发挥抗炎作用。在IBD患者结肠黏膜固有层中有大量的促炎型巨噬细胞浸润。M2型巨噬细胞可拮抗M1型巨噬细胞反应,促进组织修复。促炎型巨噬细胞和抗炎型巨噬细胞的表型和功能之间的平衡受到细胞外和细胞内刺激的调节,决定了疾病的进展。因此,恢复肠道巨噬细胞不同亚型之间的平衡,可能为临床治疗IBD提供重要的方向。促炎细胞因子IL-1β和IL-18在IBD的发病中起核心作用。IL-1β和IL-18可导致肠上皮紧密连接（tight junctions,TJs）通透性增加,破坏肠屏障完整性。IL-1β和IL-18是巨噬细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族pyrin结构域蛋白3（Nucleotide binding oligomeric domain-like receptor family Pyrin domain protein 3,NLRP3）炎性小体激活的产物。Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）-核因子-κB（Nuclear factor-κappa B,NF-κB）信号参与了NLRP3炎性小体激活。NLRP3炎性小体是由NLRP3、凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein,ASC）和前半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1（Pro-cysteine aspartic acid specific protease-1,Pro-caspase-1）组成的复合蛋白。NLRP3炎性小体一旦被激活,就会形成炎性小体的组装核,导致caspase-1介导的促炎因子IL-1β和IL-18的释放,参与肠道炎症。已有研究表明,NLRP3炎性小体及其下游分子,包括Caspase-1、IL-1β和IL-18在多种自身免疫性疾病（包括IBD）中表达上调和过度激活。肠道黏膜屏障是抵抗肠腔内容物渗透的第一道防线。肠道黏膜屏障的破坏,导致肠腔内容物移位到肠黏膜可引起炎症性疾病,从而导致组织损伤。肠道屏障的破坏或损伤被认为是IBD发病的关键决定因素。肠黏膜屏障由肠上皮单层细胞、紧密连接（Tight junction,TJs）蛋白和肠分泌物组成,阻止腔内物质和抗原通过细胞旁间隙。TJs是肠上皮细胞构成屏障的最重要组成部分,通过紧密封闭细胞-细胞连接来调节屏障的通透性。TJs蛋白包括咬合蛋白（occludin）、闭合蛋白（claudin）和闭锁小带（zonula occludens,ZO）,对维持上皮屏障的完整性至关重要。肠道通透性受TJs蛋白调控,炎症可调节TJs蛋白的表达和细胞定位。肠道TJs屏障的破坏导致TJ屏障的渗漏,导致肠道通透性的增加,从而促进肠道炎症。在IBD中可以观察到TJs蛋白的下调。因此,通过调控受损的肠屏障功能是IBD治疗的一个潜在的新靶点。目前临床用于IBD治疗的药物主要有氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等。然而,这些药物的临床应用受到胃肠道不良反应、肾毒性、严重感染和恶性肿瘤等严重不良反应的限制。因此,需要开发新的有效的且不良反应少的药物和治疗方法。芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（Paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25）是我们所自主研发的新型活性单体化合物,具有抗炎免疫调节作用,并已获得中国发明专利（发明专利号:201210030616.4）。前期研究发现,CP-25在多个自身免疫性疾病的动物模型中具有抗炎免疫调节作用。CP-25在炎症性自身免疫性疾病动物模型中通过抑制M1型巨噬细胞过度活化,增强M2型巨噬细胞激活,从而恢复巨噬细胞的功能,使其发挥抗炎免疫调节功能。利用微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）实验,分子模拟对接,氨基酸突变,免疫共沉淀等实验技术和方法,证实CP-25直接靶向G蛋白偶联受体激酶2（G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2）,抑制其激酶活性,尤其是抑制GRK2向细胞膜转移的活性。在胶原性关节炎（Collagen induced arthritis,CIA）大鼠滑膜组织中,GRK2在胞膜表达上调,导致成纤维滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）异常增殖。CP-25整体给药可通过下调GRK2的膜表达,从而改善异常增殖的FLS功能,发挥抗炎免疫调节作用。GRK2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,通过磷酸化G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）或磷酸化非GPCR调控受体脱敏和内化,在维持受体和信号转导之间的平衡中发挥重要作用。课题组前期发现,CIA小鼠巨噬细胞的GRK2异常升高,导致M1型巨噬细胞极化,CP-25可以抑制GRK2膜转位,从而促进M2型巨噬细胞极化,恢复巨噬细胞M1/M2的比例平衡,发挥抗炎免疫调节作用。然而,CP-25对DSS诱导的小鼠结肠炎是否有治疗作用?其发挥作用的机制如何?尚未见报道。目的:1、探讨GRK2对TLR4-NF-κB-NLRP3炎症小体信号通路的影响在UC发病机制中的作用及其对巨噬细胞极化和肠屏障功能的影响。明确GRK2参与介导TLR4-NF-κB-NLRP3炎性小体信号通路异常活化参与巨噬细胞极化,破坏肠黏膜屏障功能是UC发病机制之一。2、探讨CP-25对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用和阐明CP-25靶向GRK2抑制TLR4-NF-κB-NLRP3炎性小体信号通路恢复巨噬细胞极化失衡,从而保护肠黏膜屏障功能发挥治疗作用。方法:1、临床收集UC患者结肠组织标本和血清标本,HE染色观察结肠组织病理变化;ELISA法检测血清中IL-1β和IL-18水平;免疫组化法和Western blot法用于检测结肠组织中CD68的表达;qRT-PCR法和Western blot法用于检测结肠组织中GRK2的表达;Western blot法检测结肠组织中iNOS、Arg1、ZO-1、occludin、claudin-1、TLR4、p65、p-p65、NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达。2.选用巨噬细胞作为体外实验研究对象。用流式细胞术检测巨噬细胞表型CD68+CD86+和CD68+CD206+的表达;ELISA法用于检测细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平;Western blot法检测巨噬细胞中iNOS、Arg1、GRK2、TLR4、p65、p-p65、NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达;Western blot法检测巨噬细胞中GRK2的膜表达情况;免疫共沉淀和激光共聚焦法检测GRK2与TLR4的共表达情况;沉默巨噬细胞中的GRK2,检测巨噬细胞表型CD68+CD86+和CD68+CD206+的表达,细胞上清液中IL-1β和IL-18水平以及NLRP3炎性小体信号通路中关键分子蛋白的表达情况。将巨噬细胞与人源肠上皮细胞Caco-2采用Transwell共培养体系建立IBD体外炎症模型。检测肠上皮细胞跨膜电阻值（transepithelial electrical resistance,TEER）、异硫氰酸荧光素葡聚糖4（fluorescein isothiocyanate dextran 4,FD4）渗透率、肠道紧密连接蛋白（occludin,claudin-1和ZO-1）的表达水平和Caco-2的凋亡率。3、雄性C57BL/6小鼠饮用2.5%DSS溶液一周,建立小鼠结肠炎模型。将造模成功的结肠炎小鼠随机分为模型组、CP-25低中高剂量组（17.5mg/kg、35mg/kg、70mg/kg）和阳性药SASP组（300mg/kg）,同时设正常对照组。对各处理组小鼠的体重、疾病活动指数（disease activity index,DAI）评分、存活率、结肠长度、胸腺和脾脏指数等指标进行评价;HE染色观察结肠病理变化;流式细胞术检测处理组小鼠结肠巨噬细胞亚群的百分比;ELISA法用于检测各处理组小鼠血清中IL-1β和IL-18水平;免疫组化和Western blot用于检测小鼠结肠组织中ZO-1、occludin、claudin-1的表达。Western blot法用于检测小鼠结肠组织中iNOS、Arg1、GRK2、TLR4、p65、p-p65、NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达情况。结果:1、UC患者结肠黏膜巨噬细胞极化失衡、肠屏障功能障碍、以及GRK2和TLR4-NF-κB-NLRP3炎症小体信号通路异常激活UC患者结肠黏膜结构畸变,包括隐窝缩短、隐窝大小和形状变化、基底淋巴浆细胞、黏膜内多种炎症细胞严重浸润、黏膜水肿、黏膜溃疡。与健康对照组相比,UC患者结肠黏膜固有层中CD68大量浸润;与健康对照组相比,UC患者结肠组织中,M1型巨噬细胞标记iNOS表达增加,M2型巨噬细胞标记Arg1表达下降;UC患者结肠组织中TJs蛋白（claudin-1,ZO-1,occludin）表达下降;UC患者血清中IL-1β和IL-18水平显著升高;UC患者结肠黏膜组织中GRK2高表达;UC患者结肠黏膜组织中TLR4、p-p65/p65、NLRP3、ASC和Caspase-1/Pro-caspase-1表达上调。2.沉默巨噬细胞中的GRK2可抑制TLR4-NF-κB-NLRP3炎症小体信号通路的激活进而改善肠上皮细胞屏障功能与LPS刺激组相比,GRK2 siRNA组的CD68+CD86+百分含量降低,CD68+CD206+百分含量增加,CD68+CD86+/CD68+CD206+下降,iNOS表达下降,Arg1表达升高,iNOS/Arg1降低。与LPS刺激组相比,GRK2 siRNA巨噬细胞中IL-1β和IL-18表达下降,TLR4、p-p65/p65、NLRP3和Caspase-1/Pro-caspase-1表达明显下降。在Transwell共培养体系中,与M1+Caco-2组比较,GRK2 siRNA M1+Caco-2组的TEER值升高、FD4通透率降低、TJs蛋白（claudin-1,ZO-1,occludin）表达增加、Caco-2凋亡率下降。3、CP-25调控巨噬细胞极化及通过抑制GRK2进而恢复异常活化的TLR4-NF-κB-NLRP3炎症小体信号发挥改善结肠炎小鼠的治疗作用与正常组相比,DSS模型组小鼠体重下降明显。与DSS模型组相比,CP-25（35mg/kg和70mg/kg）和SASP组小鼠体重下降百分比明显减少。DAI评分结果显示,与正常组相比,DSS模型组小鼠DAI评分明显升高。与DSS模型组比较,CP-25（35mg/kg和70mg/kg）和SASP组小鼠的DAI评分明显下降。除正常组外,CP-25（70mg/kg）和SASP组小鼠的存活率最高。与DSS模型组比较,CP-25（35mg/kg和70mg/kg）和SASP可抑制小鼠结肠缩短,降低胸腺指数和脾脏指数。CP-25和SASP治疗组均可减少炎症细胞浸润,恢复受损的上皮细胞,减少黏膜下水肿,并显著降低结肠累积组织学评分。CP-25和SASP治疗组小鼠的结肠巨噬细胞亚群M1型巨噬细胞的百分比降低,M2型巨噬细胞的百分比升高,M1/M2比值下降,iNOS蛋白表达降低,Arg1蛋白表达增多,iNOS/Arg1比值降低,TJs蛋白（claudin-1、ZO-1、occludin）表达增加。与DSS模型组相比,CP-25和SASP治疗组小鼠血清和结肠组织中IL-1β和IL-18表达下降。CP-25（35mg/kg和70mg/kg）降低小鼠结肠组织中GRK2的表达。与DSS模型组相比,CP-25和SASP治疗组小鼠结肠组织中TLR4、p-p65/p65、NLRP3、ASC和Caspase-1/Pro-caspase-1表达明显下降。4.CP-25通过抑制LPS刺激的巨噬细胞中活化的TLR4-NF-κB-NLRP3炎性小体信号通路进而恢复巨噬细胞极化平衡与control组相比,LPS刺激组中CD68+CD86+百分含量增加,CD68+CD206+百分含量降低,CD68+CD86+/CD68+CD206+升高;与LPS刺激组相比,CP-25组的CD68+CD86+百分含量降低,CD68+CD206+百分含量增加,CD68+CD86+/CD68+CD206+下降,CP-25组的iNOS表达下降,Arg1表达升高,iNOS/Arg1降低。与LPS刺激组相比,CP-25可以降低巨噬细胞中IL-1β和IL-18的表达,抑制巨噬细胞中TLR4、p-p65/p65、NLRP3和Caspase-1/Pro-caspase-1的表达。5.在LPS刺激的巨噬细胞中,CP-25通过抑制GRK2转膜,恢复损伤的肠屏障功能与control组相比,LPS刺激组中GRK2总蛋白和膜蛋白水平升高;与LPS刺激组相比,CP-25组的GRK2总表达和膜表达均下降,CP-25组中GRK2与TLR4共表达下降。在Transwell共培养体系中,与M1+Caco-2组比较,CP-25+M1+Caco-2组的TEER值升高、FD4通透率降低、TJs蛋白（claudin-1,ZO-1,occludin）表达增加、Caco-2凋亡率下降。结论:1、UC的发病机制可能与GRK2介导TLR4-NF-κB-NLRP3炎症小体信号通路的异常激活导致巨噬细胞极化失衡,造成肠道黏膜屏障破坏有关。2、CP-25对DSS诱导的小鼠结肠炎有治疗作用,可能与其调节巨噬细胞极化失衡修复损伤的肠黏膜屏障功能有关。3、CP-25可以通过减少GRK2与TLR4的结合抑制TLR4-NF-κB-NLRP3炎症小体信号通路的活化,恢复巨噬细胞极化平衡,保护肠黏膜屏障。