第一部分ZHX2在成人急性B淋巴细胞白血病中的作用及机制研究研究背景：急性淋巴细胞白血病(ALL)是一类淋巴细胞B或者T系在骨髓内异常克隆增生的恶性血液系统疾病,恶性增生的原始淋巴细胞在骨髓中聚集并抑制其正常造血功能,同时浸润骨髓外其他组织,严重威胁人类健康。近些年来,随着化疗和骨髓移植等治疗手段的进步,儿童ALL患者的治愈率可达80%,然而成人ALL患者的治疗效果仍然较差,长期生存率低于40%。急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)约为急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)的3-4倍,约占儿童ALL的85%、成人ALL的75%。目前认为B-ALL的发生是遗传、环境和生物等多种复杂因素共同作用的结果,具体病因不明确。因此,探索B-ALL发病机制,寻求更为有效的治疗策略意义重大。ZHX2是ZHXs家族新近发现的一名新成员,其能够调节多种基因的转录,从而参与造血细胞发育、红细胞分化、神经前体细胞的维持。研究表明在B细胞相关的恶性血液系统疾病中如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤等,ZHX2发挥了非常重要的作用,与疾病的预后密切相关,发挥肿瘤抑制作用。然而,ZHX2在成人B-ALL中的作用及机制研究目前国内外尚无报道。研究目的：检测ZHX2在成人B-ALL患者中的表达水平,分析其与患者临床特征和临床预后的关系,研究ZHX2对B-ALL细胞增殖、药物敏感性的影响,试图阐明ZHX2对B-ALL细胞信号通路的影响,探讨ZHX2对成人B-ALL治疗的意义。研究方法：1.标本采集：收集37例初诊成人B-ALL患者和30例正常对照者的骨髓标本。采用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞。2.实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(real-time RT-PCR)法：采用TRIzol法提取骨髓单个细胞总RNA,应用PrimeScript(?) RT Master Mix将RNA逆转录为cDNA,应用real-time RT-PCR法检测骨髓单个核细胞中ZHX2、 Hes1基因mRNA表达水平。3. Western Blot法：采用总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳,应用Western Blot法检测骨髓单个核细胞中ZHX2、Notch1、Hes1、p27蛋白水平的表达。4.细胞存活实验：细胞进行处理后应用CCK8法检测细胞存活情况。5.流式细胞学检测细胞周期：应用细胞周期检测试剂盒检测ZHX2对细胞周期分布的影响。6.统计学分析：采用统计学软件GraphPad Prism 5.0进行分析,实验数据符合正态分布的以均数±标准差表示,实验数据不符合正态分布的以中位数和范围表示。应用Student t、 Mann-Whitney U或是Kruskal-Wallis检验分析B-ALL患者组和正常对照组中ZHX2、Hes1等的表达差异；应用Two-way ANOVA检验分析病毒转染前后Nalm-6细胞增殖、对化疗药物敏感性的差异是否具有统计学意义；应用Spearman秩相关分析B-ALL患者ZHX2的表达水平与其他基因表达水平的相关性；应用Chi-square检验分析ZHX2表达水平与患者临床特征间是否具有统计学关系；应用Kaplan-Meier生存曲线分析各组B-ALL患者的生存率,log-rank检验各组生存率的差异。P<0.05为具有统计学意义差异。研究结果：1.ZHX2在初诊成人B-ALL患者骨髓中的表达：Real-time RT-PCR结果显示初诊成人B-ALL患者骨髓单个核细胞中ZHX2基因mRNA表达水平明显低于正常对照组。2.ZHX2与初诊成人B-ALL患者临床特征的相关性：(1) ZHX2 mRNA表达水平在Ph+B-ALL和Ph-B-ALL两组中表达无明显差异；(2) ZHX2 mRNA高表达水平与B-ALL患者低危年龄(15-39岁)密切相关；(3)在Ph+B-ALL患者组, ZHX2mRNA高表达水平与患者良好预后因素(年龄15-39岁,WBC<30x109/L)密切相关；3.ZHX2与初诊成人B-ALL患者临床预后的相关性：(1)ZHX2高表达组患者总体生存时间较ZHX2低表达组明显延长；(2)ZHX2高表达组患者CR持续时间较ZHX2低表达组延长；(3) Ph+B-ALL患者中,ZHX2高表达组患者总体生存时间较ZHX2低表达组明显延长；4.ZHX2抑制B-ALL细胞的增殖：ZHX2过表达后,Nalm-6细胞的生长速度较空白对照组显著下降。5.ZHX2对B-ALL细胞细胞周期的影响：ZHX2过表达后,Nalm-6细胞G0/G1期比例明显增加,而G2/M期和S期比例无明显改变。6.ZHX2对B-ALL细胞化疗药物敏感性的影响：ZHX2过表达后,化疗药物地塞米松和去甲氧柔红霉素对Nalm-6细胞生长的抑制率明显增高,并呈剂量效应关系。7.ZHX2对B-ALL细胞信号通路的影响：(1)ZHX2过表达可导致p27蛋白水平明显增加；(2)ZHX2过表达可导致Notchl分子的激活增加,但是Hes1蛋白水平轻度降低；(3)ZHX2与Hes1在蛋白水平存在相互作用。结论：1.初诊成人B-ALL患者ZHX2 mRNA表达水平显著低于正常对照者；2.ZHX2表达水平与初诊成人B-ALL患者的临床特征和临床预后密切相关；3.ZHX2抑制B-ALL细胞增殖,同时增加细胞对化疗药物的敏感性,提示其肿瘤抑制作用；4.进一步探索ZHX2在B-ALL细胞中的作用,可能为B-ALL的治疗开辟新途径。第二部分异常Th亚群与淋巴瘤临床相关性研究研究背景：淋巴瘤是一组起源于淋巴结或是结外淋巴组织的恶性血液系统疾病,约占世界恶性肿瘤的3%-5%。按组织病理学,淋巴瘤可分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；按细胞来源,其可分为B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤。近年来,随着诊断和治疗手段的发展,淋巴瘤的预后得到一定改善,但是仍有部分患者治疗效果不佳。淋巴瘤也属于免疫系统恶性肿瘤,其病因和发病机制目前仍不完全清楚。研究表明T细胞的异常表达与机体的免疫功能紊乱以及一些血液系统疾病的发生发展密切相关。Th17和Th22细胞为近年来新发现的两类T辅助(Th)细胞,研究证实它们不仅在外周免疫反应中发挥着重要作用,而且在肝癌、胃癌和肺癌等恶性肿瘤中也发挥着不可忽视的作用。然而,国内外尚无有关Th17和Th22细胞在淋巴瘤中的详细报道。研究目的：在本研究中,我们检测了淋巴瘤患者外周血中Th1、Th17和Th22细胞的比例,以及Th亚群相关细胞因子在外周血血清中的分泌情况,研究上述Th亚群与淋巴瘤患者临床特征和疾病进展的关系,为进一步研究Th1、Th17和Th22细胞在血液系统肿瘤免疫机制中的作用提供基本资料。研究方法：1.标本采集：收集57例淋巴瘤患者和39例正常对照者的外周血标本,采用差速离心法分离出外周血上清。2.流式细胞学技术：新鲜外周血经过PMA、离子霉素和莫能霉素刺激后,应用流式细胞学技术检测Th1、Th17和Th22细胞在患者和正常对照者外周血中所占比例。3.酶联免疫吸附试验(ELISA)法：血清离心去细胞碎片后分装并储存于-80℃,应用ELISA方法检测血清中IL-17AA、IL-17FF、IL-17AF、IL-22和IL-6蛋白的分泌。4.统计学分析：采用统计学软件GraphPad Prism 5.0进行分析,P<0.05为具有统计学意义差异。研究结果：1.初诊淋巴瘤患者外周血中Th1、Th17和Th22细胞水平：(1) Thl (CD4+IFN-y+)细胞在初诊淋巴瘤患者外周血中的比例较正常对照组明显增多；(2)与正常对照组相比,Th1细胞在初诊B-NHL患者组和T-NHL患者组外周血中的比例显著升高,而初诊HL患者组无明显改变；(3) Th17 (CD4+IL-17+)细胞在初诊淋巴瘤患者外周血中的比例较正常对照组明显减少；(4)与正常对照组相比,Thl7细胞仅在初诊B-NHL患者组外周血中的比例显著下降,而初诊T-NHL患者和HL患者组无明显改变。(5) Th22 (CD4+IFN-γIL-17TL-22+)细胞在初诊淋巴瘤患者外周血中的比例较正常对照组明显上升；(6)与正常对照组相比,Th22细胞在初诊B-NHL患者组和T-NHL患者组外周血中的比例显著升高,而初诊HL患者组无明显改变；2.初诊B-NHL患者外周血上清中Th17、Th22相关细胞因子水平：(1)初诊B-NHL患者血清中IL-17AF浓度显著低于正常对照者,而IL-17AA血清浓度在初诊B-NHL患者组与正常对照组间无明显差异。此外,IL-17FF在初诊B-NHL患者和正常对照者外周血上清中均检测不出。(2)初诊B-NHL患者血清中IL-22和IL-6浓度明显高于正常对照组。3. Spearman相关分析得出,初诊B-NHL患者外周血中Th22细胞比例与Th17细胞比例呈正相关。4. B-NHL高年龄组(>60岁)患者外周血中Th22细胞比例较低年龄组(S60岁)显著增高。5. Th1、Th17和Th22细胞与B-NHL患者疾病发展的关系：(1) B-NHL患者外周血Thl细胞比例在化疗后较初诊时明显降低,并较正常对照者无明显差别。Thl细胞比例在复发B-NHL患者与初诊B-NHL患者间无明显差异。(2) B-NHL患者外周血Th17细胞比例在化疗后较初诊时明显升高,并较正常对照者无明显差别。Th17细胞在复发B-NHL患者外周血中比例较初诊B-NHL患者和正常对照者均显著增高。(3) B-NHL患者外周血Th22细胞比例在化疗后较初诊时明显降低,并较正常对照者无明显差别。Th22细胞在复发B-NHL患者外周血中比例较初诊B-NHL患者显著增高。结论：1. Th1、Th17和Th22细胞在淋巴瘤尤其是B-NHL患者中异常表达。2. B-NHL患者经过化疗后,异常表达的Th1、Th17和Th22细胞趋于正常化。3. Th1、Th17和Th22细胞与B-NHL患者临床特征和疾病进展具有一定的相关性。4.进一步研究Th亚群在血液系统肿瘤免疫机制中的作用,可以为血液系统肿瘤的治疗开辟新途径。