猪血凝血酶、免疫球蛋白等5种蛋白质和血红素的分离提取

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猪血富含多种生物活性成分,是宝贵的生物资源,蕴藏着巨大的开发潜力和利用价值。本论文以提高猪血的综合利用价值为目的,对猪血浆中纤维蛋白原、凝血酶、白蛋白、免疫球蛋白的连续分离工艺以及对猪血红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和血红素的同步分离工艺进行了研究,主要实验内容如下: 1.猪血的抗凝处理、红细胞和血浆的分离条件。收集经检验合格的新鲜猪血,用3.8%的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1:9混合抗凝;抗凝血在转速4000 r/min下,离心10min,收集血浆和红细胞分别进行处理。 2.研究了血浆中纤维蛋白原、凝血酶、免疫球蛋白、白蛋白的提取方法和条件。利用血浆中纤维蛋白原的冷沉淀性质,先对血浆进行冻融处理,分离纤维蛋白原(凝血酶的作用底物),再选用专一吸附剂柠檬酸钡吸附凝血酶原,最后以盐析法分离免疫球蛋白和白蛋白。优化后条件如下: (1)抗凝血桨在-20℃下冷冻12h,4℃下解冻,2500r/min转速下离心5min,收集沉淀和上清液。沉淀的主要成分为纤维蛋白原,经检测样品中纤维蛋白原含量82.6%,纤维蛋白原提取率为91.0%。 (2)上述上清液中按体积比加入血浆体积8%1mol/L的氯化钡,离心收集上清(提取白蛋白和免疫球蛋白)和沉淀。沉淀用0.2mol/L pH8.0:EDTA解析得凝血酶原。凝血酶原中加入2mol/LCaCl<,2>,使Ca<2+>终浓度为0.1mol/L,25℃下激活2h。经离子交换纯化后,凝血酶的比活达到604.4U/mg,回收率为74.3%,纯化倍数为15.7。再经Sephadex G-75进一步纯化,用0.05mol/L,、pn7.2的Tris-HCl缓冲液上样、洗脱,得到凝血酶电泳单点纯,比活为1072.8U/mg,回收率为69.7%,纯化倍数为27.9。 (3)在上清液中加入终浓度为50%饱和硫酸铵,调节溶液pH值为7.2,4℃下静置2h,在4℃、10000r/min转速下离心20min,上清液经透析,浓缩得白蛋白粗品。沉淀主要含有免疫球蛋白。检测白蛋白的量为31.41g/L血浆,样品中白蛋白纯度为93.1%,白蛋白提取率为90.5%。免疫球蛋白的量为13.86g/L血浆,样品中免疫球蛋白纯度约为80.3%,提取率为91.8%。 3.对红细胞中SOD和血红素的同步提取工艺进行了研究。工艺参数如下: (1)红细胞的超声波破碎条件为:加入红细胞体积1/5的去离子水,超声波功率200W,破碎时间为15min,得到红细胞溶解液。 (2)SOD提取条件为:在红细胞溶解液中加入0.25倍的预冷乙醇和0.15倍预冷氯仿,使血红蛋白变性沉淀。上清中加入2倍体积的冷丙酮沉淀SOD,把沉淀溶于磷酸缓冲液后,再经Cu<2+>热变性等操作提取SOD。所得SOD粗品比活为1650.9U/mg,回收率为83.3%。 (3)血红素提取条件:向血红蛋白沉淀中加入红细胞体积5倍的丙酮,调其pH值为2.2。此条件下血红素溶于酸性丙酮中,而珠蛋白沉淀,收集提取液;利用鞣酸法从提取液中沉淀血红素。利用本工艺每L猪血可以获得血红素3.0克左右,纯度达到91%左右,提取率为71%左右。 本实验通过猪血中众多活性成分提取分离的工艺研究,对猪血进行了开发利用,使猪血的综合利用程度和附加值都得到提高,为综合利用猪血探索了新的思路和方法。
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