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目的意义卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)指妇女40岁之前出现的非生理性月经停止,为临床常见的妇科疾病,诱发一系列生殖内分泌及健康等问题,严重者会丧失生殖能力。尤其随着现代生活节奏加快、生活压力增大,卵巢早衰的发病率逐年升高,近年来甚至有年轻化趋势。化疗作为治疗免疫性疾病和肿瘤的常用手段,疗效确切,广泛应用于临床;但化疗药物对靶细胞选择性较差,不仅杀死病变细胞,对正常组织和细胞也会造成不同程度的损伤。随着化疗导致卵巢功能低下和不孕的报道日渐增多,化疗作为引发POF重要原因之一日益受到人们的关注。顺铂(cisplatin,CDDP)即为临床常用的化疗药物,有不少报道称其对卵泡发育有一定损伤,并具有卵巢毒性。本实验室在前期研究中已成功建立了顺铂诱导卵巢早衰的动物模型。FOX03a转录因子为FOXO蛋白家族的成员之一,参与细胞的增殖、生长、分化、凋亡及衰老等重要生命过程的调控。此外,FOX03a转录因子是磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase-protein-kinaseB,PI3K-AKT)信号通路下游的重要靶蛋白之一,通过调节非特异性周期依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)P27kip1和前凋亡蛋白Bim来调控细胞周期及细胞凋亡。中医验方二仙汤是补肾常用方药,现代药理研究表明其对性腺、内分泌及免疫系统、骨质疏松等均具有显著的改善作用,临床上普遍应用于妇女围绝经期综合症、更年期高血压、绝经期骨质疏松、前列腺炎等疾病的治疗,对卵巢早衰也有显著疗效。目前对二仙汤的实验研究大多为在体动物模型的形态学观察及生理生化指标的检测,而分子机制方面的研究少有报道。二仙汤治疗化疗损伤性卵巢早衰的分子作用机制尚未阐明,尤其基于FOX03a转录因子探讨二仙汤对顺铂损伤卵巢颗粒细胞的分子保护机制国内尚未有研究。本实验以离体大鼠卵巢颗粒细胞为研究对象,基于FOX03a-P27kip1/Bim途径探讨补肾验方二仙汤对卵巢颗粒细胞增殖及凋亡的作用机制,以期为二仙汤应用于临床治疗卵巢早衰提供更为详实有力的理论依据。研究方法提取原代大鼠卵巢颗粒细胞,利用顺铂制备颗粒细胞损伤模型,分别给予正常、戊酸雌二醇、二仙汤高、中、低剂量药理血清(大鼠源),观察二仙汤药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞的干预效果:MTT法检测二仙汤药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞增殖的影响;流式细胞术检测二仙汤药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞周期及凋亡的影响;免疫组织化学法检测二仙汤药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞中FOXO3a、P27kip1、Bim表达定位的影响,同时加入LY294002抑制剂,进一步验证二仙汤药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞的保护机制是否与调控FOXO3a及P27kip1、Bim的表达有关;蛋白印迹法检测二仙汤药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞中FOX03a、P27kip1、Bim表达水平的影响。研究结果1.二仙汤对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响二仙汤各剂量药理血清对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞均具有明显的增殖促进作用,其中,中剂量组效果最为显著;药理血清的增殖促进作用一直持续到72h,且以48h作用效果最为显著。因此本研究选择48h为药理血清作用时间。2.二仙汤对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞周期及凋亡的影响(1)二仙汤各剂量药理血清均能影响顺铂损伤卵巢颗粒细胞的周期时相变化:使S期细胞显著增多,Go/G1期细胞相对减少,增殖指数升高。各剂量组间无差异,其中低剂量组增殖效果较好。(2)二仙汤各剂量药理血清均能降低顺铂损伤卵巢颗粒细胞的凋亡率,中剂量组效果最为显著。3.二仙汤对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞中FOXO3a/P27kip1/Bim蛋白表达的影响(1)FOXO3a在胞质胞核内均有表达,P27kip1主要表达于胞核,Bim主要表达于胞质;顺铂诱导FOXO3a在胞核内的表达,核内阳性颗粒明显增多,同时诱导P27kip1、Bim高表达,二仙汤各剂量组则均能明显降低三者阳性颗粒的表达;平均光密度分析结果显示,模型组与正常组相比,FOXO3a、P27kip1、Bim的平均光密度均有明显增加,而戊酸雌二醇组和二仙汤各剂量组与模型组相比,三者平均光密度值均有显著降低,各剂量组之间无差异,以中剂量效果较好。加抑制剂LY294002各组与对应不加抑制剂各组相比,FOXO3a、P27kip1、Bim阳性颗粒的表达均明显增加且三者的平均光密度值均有所升高。(2)蛋白印迹结果显示,模型组与正常组相比,FOXO3a、P27kip1、Bim的相对表达量均显著增加,而戊酸雌二醇组和二仙汤各剂量组与模型组相比,三者相对表达量均有明显降低。总体上,各剂量组之间无明显差异,低剂量效果较好。结论1.二仙汤对顺铂损伤卵巢颗粒细胞具有一定的保护作用,一方面可能是由于二仙汤能够影响颗粒细胞周期时相,促进颗粒细胞从G0期向S期转化,增加S期细胞比率,提高增殖指数;另一方面可能是由于二仙汤能够降低顺铂诱导的颗粒细胞凋亡。2.二仙汤通过下调FOXO3a的表达,进而下调细胞周期阻滞蛋白P27kip1及促凋亡蛋白Bim的表达,从而促进卵巢颗粒细胞增殖,抑制其凋亡,对顺铂损伤的卵巢颗粒细胞具有一定的保护作用。