【摘 要】
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目的:探讨CLEC4M对鼻咽癌细胞黏附、侵袭和迁移的影响,进一步了解CLEC4M与鼻咽癌淋巴结转移之间的关系。方法:1.通过Realtime-PCR检测本实验室常见鼻咽癌细胞株及人淋巴管内皮细胞株(human lymphatic endothelial cell,HLEC)中 CLEC4M 基因的表达情况。2.将HLEC细胞分别感染CLEC4M空载、颈段7个重复序列及9个重复序列的慢病毒,并通过琼
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目的:探讨CLEC4M对鼻咽癌细胞黏附、侵袭和迁移的影响,进一步了解CLEC4M与鼻咽癌淋巴结转移之间的关系。方法:1.通过Realtime-PCR检测本实验室常见鼻咽癌细胞株及人淋巴管内皮细胞株(human lymphatic endothelial cell,HLEC)中 CLEC4M 基因的表达情况。2.将HLEC细胞分别感染CLEC4M空载、颈段7个重复序列及9个重复序列的慢病毒,并通过琼脂糖凝胶电泳、Realtime-PCR、Western Blot等实验从分子水平和蛋白水平验证感染慢病毒后HLEC细胞中CLEC4M的过表达情况。3.将构建好的稳定过表达CLEC4M的HLEC细胞株与鼻咽癌细胞5-8F、6-10B共培养,通过小管形成实验和细胞洗脱实验验证CLEC4M对鼻咽癌细胞的黏附作用。此外,还将鼻咽癌细胞5-8F和6-10B分别与CLEC4M人重组蛋白共孵育,运用流式细胞术进一步验证CLEC4M与鼻咽癌细胞的黏附能力。4.通过Transwell细胞侵袭和迁移实验以及细胞划痕实验验证CLEC4M对鼻咽癌细胞5-8F和6-10B侵袭和迁移能力的影响。结果:1.Realtime-PCR的结果显示在内参GAPDH的Ct值为16-17之间时本实验室常见鼻咽癌细胞株HK1、CNE1、CNE2、HONE1、5-8F、6-10B中CLEC4M的表达量无法测出,而HLEC细胞可低量表达CLEC4M。2.琼脂糖凝胶电泳、Realtime-PCR以及Western Blot的实验结果表明成功构建稳定过表达空载、7重复及9重复CLEC4M的HLEC细胞株(HLEC-CLEC4M-control、HLEC-CLEC4M-7、HLEC-CLEC4M-9)。3.小管形成实验可见HLEC细胞在基质胶表面呈管状生长,鼻咽癌细胞5-8F及6-10B黏附其上围绕HLEC也呈管状生长。4.细胞洗脱实验发现在接种鼻咽癌细胞1h后进行洗脱,各组之间即表现出明显差异,且黏附的鼻咽癌细胞数量具有时间依赖性。表现为5-8F细胞及6-10B细胞大部分黏附在过表达CLEC4M的HLEC细胞上,且在有HLEC细胞存在的条件下鼻咽癌细胞更难被洗脱;此外,HLEC-CLEC4M-7组和HLEC-CLEC4M-9组所黏附的鼻咽癌细胞数量较HLEC-CLEC4M-control组更多,且黏附的5-8F细胞数量明显高于6-10B细胞数量。5.Transwell细胞侵袭和迁移实验表明HLEC-CLEC4M-7组和HLEC-CLEC4M-9组可明显促进鼻咽癌细胞5-8F、6-10B的侵袭和迁移,且对5-8F细胞的侵袭和迁移作用高于6-10B细胞;当用甘露糖处理HLEC-CLEC4M-7细胞后,其对5-8F细胞及6-10B细胞的侵袭和迁移作用稍降低。6.细胞划痕实验可见HLEC细胞表现出明显向5-8F细胞和6-10B细胞生长的趋势,且HLEC-CLEC4M-7组和HLEC-CLEC4M-9组的迁移能力明显高于HLEC-CLEC4M-control组;在加入甘露糖后,HLEC-CLEC4M-7细胞对5-8F细胞和6-10B细胞的迁移作用略微降低。结论:1.成功构建了稳定过表达空载、7重复及9重复CLEC4M的HLEC细胞株。2.CLEC4M对鼻咽癌细胞的黏附、侵袭和迁移能力具有一定的促进作用,且此过程可被甘露糖抑制。3.CLEC4M颈段重复序列之间的微小差异对鼻咽癌细胞黏附、侵袭及迁移的影响并不明确,仍需进一步讨论。4.CLEC4M对鼻咽癌细胞具有黏附作用,可能在一定程度上通过诱导鼻咽癌细胞向淋巴结侵袭和迁移,从而促进鼻咽癌淋巴结转移。
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