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周围神经损伤后的修复是外科领域的一大难题。现代化交通和工业的迅速发展以及重大的自然灾害都是周围神经损伤的重要因素,发生率越来越高的周围神经损伤给人们的日常生活带来巨大痛苦并给社会带来巨大的经济负担。较小的神经缺损可作端-端缝合,较大的缺损无法做端-端吻合则需要用移植物代替。但是后者存在很多缺点,如需要多次手术、牺牲健康神经并造成供体部位的功能缺失。如今,组织工程技术的发展为治疗周围神经缺损提供了新的策略。
因为具有自我增殖速度快并且具有多向分化潜能的特征,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)成为一种十分具有吸引力的组织工程种子细胞来源。大量实验表明,骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymalstem cell,BMMSC)能够促进周围神经再生。同时,有研究发现大鼠BMMSC表达神经营养因子(neurotrophic factor,NF),包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)和胶质源性神经营养因子(GDNF),并且BMMSC促进周围神经损伤修复的机制与神经营养因子有关。另一项研究也认为,BMMSC对脑损伤的保护作用主要是其神经营养因子的合成。
然而,BMMSC的取材是一个高侵害的过程,并且骨髓中的间充质干细胞的比例相对较低,因此急需寻找它的替代来源。
近年来,另外一种间充质干细胞一脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)成为组织工程的研究热点。与BMMSC相比,除了具有相似的表型和基因表达特征外,ADSC还具有其独特的优势:①人类具有丰富的皮下脂肪,来源广泛;②能够通过安全的常规吸脂术获得,取材方便;③脂肪组织中的间充质干细胞的比例高于骨髓;④ADSC增殖速度快于BMMSC。
既然ADSC具有这些优势,是否可以说ADSC就是一种理想的神经组织工程种子细胞昵?有一系列问题摆在我们面前:①ADSC是否能够合成和分泌NF;②ADSC是否能够促进周围神经损伤的修复;③ADSC是否能在同种异体动物体内长时间存活;④如果ADSC能够促进周围神经损伤的修复,那么其机制可能是什么?
目的：
本实验将在体外原代培养ADSC并在细胞水平检测各种NF的表达情况,另外以ADSC为种子细胞,以脱细胞神经同种异体移植物(acellular nerve allografts,ANA)为支架构建组织工程神经应用到大鼠坐骨神经缺损模型,来观察ADSC是否具有促进神经再生的作用,并进一步探讨其机制。
实验方法：
一、ADSC的分离、培养和鉴定
采用3-4周的雄性Wistar大鼠,从腹股沟获得脂肪组织,应用酶消化法分离ADSC,并培养至第三代。
取第三代ADSC分别在成骨诱导培养基和成脂诱导培养基中进行培养,观察其形态的改变。茜素红染色和油红O染色分别鉴定ADSC向骨细胞和脂肪细胞分化的能力。
二、ADSC和BMMSC的增殖检测
应用噻唑蓝(MTT)比色法,分别对第一代和第三代ADSC、BMMSC绘制生长曲线,对二者进行比较。
三、ADSC细胞水平的检测
(一)神经营养因子(NF)
应用RT-PCR和ELISA方法分别在mRNA和蛋白水平检测ADSC神经营养因子的表达。
(二)神经细胞粘附分子(NCAM)
应用免疫细胞化学方法观察ADSC是否表达NCAM。
四、组织工程神经的制备
(一)ANA的制备
Wistar大鼠,经麻醉后取出两侧的坐骨神经,采用化学萃取脱细胞方法制备ANA,作为神经组织工程支架。
(二)移植细胞的标记
应用PKH-26荧光染料标记ADSC。
(三)组织工程神经移植物
取标记后的ADSC,用微量注射器按照接种浓度为1×106/mL注入到脱细胞神经支架内并置于CO2培养箱内联合培养3天,备用。
五、实验动物、分组和手术
雄性Wistar大鼠48只(200-250g,由中国医科大学实验动物部提供)按照实验设计分为3组,即DMEM组(支架内单纯注射培养基)、ADSC组(支架内注射ADSC和培养基)和自体移植组。
用长10mm组织工程神经桥接于大鼠右侧坐骨神经10mm缺损处。自体移植组将切断的1cm的神经翻转180度过来缝合。
六、检测手术12周后坐骨神经功能恢复情况
(一)行为学检测
足迹实验检测大鼠坐骨神经功能指数(sciatic function index,SFI),观察其神经功能恢复情况。
(二)电生理检测
应用神经电图仪描记电位,检测神经传导速度、潜伏期和波幅,从神经电生理角度观察其功能恢复情况。
(三)胫骨前肌湿重比
检测胫骨前肌湿重比,从其靶器官的角度观察其功能恢复情况。
(四)形态学检测
甲苯胺蓝染色观察再生神经的有髓纤维数目、轴索直径和髓鞘厚度,透射电镜观察髓鞘变性恢复情况。
七、移植细胞的检测
12周时应用免疫组织荧光方法检测移植物内PKH-26标记的ADSC发出的荧光信号,以确定移植细胞是否在宿主体内存活。
八、神经移植物内NF的检测
应用RT-PCR法检测术后3天和12周神经移植物内NF的表达,进一步探讨ADSC促进周围神经修复的机制。
九、统计学分析
各组实验重复三次。实验数据以-x±S表示,应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析和处理。P＜0.05为差异有统计学意义。
实验结果：
一、ADSC的多向分化能力
ADSC具有成脂和成骨潜能揭示其干细胞的特征,并且ADSC比BMMSC增殖快。
二、ADSC细胞水平特征
ADSC表达NGF、BDNF、NT-3、GDNF、CNTF和LIF等NF和NCAM。
三、ADSC能够促进坐骨神经再生
ADSC能够促进坐骨神经再生,通过以下方面证明:①足迹分析证明大鼠行为学方面的提高;②胫前肌湿重比的提高;③神经传导速度和波幅的增加,潜伏期缩短;④移植物内有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴索直径的增加。
四、ADSC的追踪
免疫荧光发现的PKH-26荧光信号提示在ADSC移植12周后在宿主体内存活。
五、移植物内NF的表达
在术后3天,在ADSC组神经移植物内检测NF的表达,然而在DMEM组没有检测到。12周后,ADSC组的神经营养因子中BDNF、NT-3和GDNF表达高于DMEM组,具有统计学意义。
结论：
1、ADSC表达NF和NCAM,提示其具有促进神经再生的潜能。
2、ADSC能够在宿主组织内存活较长时间并且能够促进神经再生,提示ADSC是一种理想的神经组织工程种子细胞。
3、ADSC对于神经再生的促进作用与NF的生成有关。