雄激素受体(AR)信号是前列腺癌发生发展的核心信号,信号的异常活化会激活下游靶基因,促进细胞增殖和前列腺癌的发生,并直接导致前列腺癌的激素非依赖性恶性转化。因此,寻找和发现新型AR调控因子,特别是抑制因子,是阻止前列腺癌恶性转化和发展的关键。TGF-β/Smads信号是细胞内最重要的分化信号,而Smad4是实现TGF-β/Smads信号转导的核心蛋白。在包括前列腺癌的多种肿瘤中,由于Smad4的表达缺失或活性失调,无法实现TGF-β对细胞分化的诱导,从而使细胞发生EMT等恶性转化。所以,系统研究Smad4对肿瘤关联信号的调控具有重要意义。本项目系统地研究了 Smad4对AR的SUMO化修饰与转录活性的调节机制,提供了前列腺癌增殖信号和分化信号之间的交叉调控的分子靶点。首先,我们研究了 Smad4对AR转录活性的影响。在过表达AR的人胚肾细胞系HEK293及前列腺癌细胞系LNCaP中表达及敲除Smad4,通过荧光素酶报告基因实验检测AR介导的下游靶蛋白前列腺特异性抗原基因(PSA)和雄激素受体反应元件(ARE)报告基因转录活性的变化。我们发现Smad4的表达可以抑制AR对PSA报告基因及ARE报告基因的转录激活,而敲除Smad4可以逆转这种抑制作用。然后,我们又通过免疫印迹实验证明,在LNCaP细胞中Smad4的表达对AR下游靶蛋白PSA与KLK2的表达水平具有显著地抑制作用;敲除Smad4可以逆转抑制作用。这些结果提示了 Smad4对AR的转录活性具有抑制作用。AR蛋白的转录活性受到其蛋白质修饰方式的调节。其中,SUMO化修饰是一种新型的蛋白质修饰方式,表现为通过连接酶系统,将小分子SUMO蛋白添加到靶蛋白上,改变蛋白的转录活性和生理功能。AR作为SUMO的底物蛋白含有K386与K520两个SUMO化位点,K386与K520位点的突变会导致AR转录活性的降低。利用荧光素酶报告基因实验,我们检测了 Smad4对野生型及K386/520R位点突变型AR介导的PSA报告基因转录活性的作用,在LNCaP细胞中发现Smad4对AR转录活性的抑制作用随着AR SUMO化位点的突变而消失,表明SUMO蛋白参与Smad4对AR转录活性的抑制。同时我们在研究中发现,在Smad4抑制AR介导的PSA报告基因转录活性的过程中,敲除SUMO1可以阻断Smad4对AR的抑制作用,而敲除SUM03则不能;并且过表达Smad4可以增强SUMO1的抑制作用。结果提示了,SUMO1蛋白参与Smad4对AR转录活性的抑制。然后,我们分析了 Smad4对AR的SUMO化修饰的影响。免疫印迹实验发现Smad4的共表达使AR出现了一条修饰带,随着Smad4表达量的增加,这条修饰带表达增强,免疫沉降后可以被SUMO1抗体所识别。而Smad4不能介导SUMO化位点突变型AR发生修饰,说明Smad4促进AR发生SUMO化修饰。进而,我们又检测了 Smad4对外源性SUMO1介导的AR修饰的影响,发现Smad4可以显著增强AR的SUMO1修饰作用,而基因沉默Smad4后,AR难以被SUMO1所修饰;所以我们证明Smad4是一种新型的AR发生SUMO化修饰调控因子,K386/520R的SUMO位点突变型AR不能被Smad4所调节,发生修饰变化,更加证明Smad4对AR的SUMO化修饰调节作用。接下来,我们通过研究了基因沉默Smad4后AR的SUMO1修饰的变化。shRNA沉默Smad4后,显著降低了SUMO1对AR的修饰作用。这些结果从正反两方面说明Smad4是调控AR的SUMO化修饰的关键因子。进一步,我们通过免疫荧光实验研究了 Smad4对AR的细胞定位的影响。发现野生型AR在细胞核内均匀分布;而当AR与Smad4共表达时,Smad4促进AR在细胞核内的聚集,AR与Smad4在细胞核内凝聚呈成点状,这种形态变化与AR与SUMO1共表达时的图像非常相似。进一步我们又通过免疫荧光检测Smad4对AR/SUMO1复合物的调节作用。SUMO1与AR在细胞核内共同凝聚成点状;这种效应可以被Smad4的共同表达所增强,表现为三者在核内的进一步凝集;但是共表达Smad4-shRNA沉默Smad4后,SUMO1与AR复合物分开,AR又表现为弥散性分布。但是,Smad4与SUM01均不能介导SUMO化位点突变型AR在核内凝聚成点状。这些结果表明,Smad4对AR的SUMO1修饰具有促进作用。接下来,通过GST pull down实验我们验证了 Smad4调控AR的关键功能域。我们发现,GST-Smad4-MH1和GST-Smad4-MH2均与AR具有体外结合能力,而Smad4的K113位点突变会降低GST-Smad4-MH1与AR的体外结合能力,提示了 MH1的K113位点参与Smad4与AR的相互作用。并且,我们还发现,SUMO1的共表达可以增强GST-Smad4-MH1与AR的体外结合能力。然后我们进一步确认了 Smad4的K113位点在AR的SUMO1修饰过程中的参与作用,我们进行了 Smad4野生型和SUMO位点突变型(K113R)和(K159R)以及双突变型(K113/159R)对AR的SUMO修饰情况的比较,发现野生型与K159R型Smad4均可以诱导AR发生SUMO1修饰,而K113R与K113/159R型Smad4失去了对AR的修饰的调节能力,证明Smad4是通过其K113位点调控AR的SUMO修饰。进而,我们检测了各型Smad4对AR转录活性的调控作用,发现野生型与K159R型Smad4均抑制AR介导的PSA启动子的转录活性,而K113R与K113/159R型Smad4失去了对AR/PSA信号的抑制,说明第113位赖氨酸残基是Smad4调控AR的SUMO化修饰和抑制AR的转录活性的关键功能域。所以我们证明,Smad4的MH1具有AR的结合能力,且这种作用可被SUMO1的共表达所增强,Smad4的K113位点参与了 Smad4与AR的相互作用。接下来,我们通过GST pull down实验我们验证了又研究了 GST-Smad4-MH1与野生型AR或者SUMO位点突变型AR(K386R,K520R,K386/520R)的体外结合情况,发现 AR(K386R)及 AR(K386/530R)与 GST-Smad4-MH1 物理结合能力较弱,说明了 K386位点是AR与Smad4结合的关键氨基酸。所以我们证明,AR的K386位点参与了 AR与Smad4之间的相互作用。我们进一步确认了 AR的K386位点在对Smad4调控AR信号的意义,我们比较了 Smad4对野生型AR和SUMO位点突变型AR(K386R)和(K520R)以及双突变型AR(K386/520R)修饰情况的不同,发现野生型和K520R型AR可被Smad4诱导,发生SUMO1修饰,而K386R和K386/520R型AR则失去了对Smad4的反应性,Smad4对这两型AR的SUMO1修饰促进作用消失,证明Smad4是调控AR的K386位点SUMO化修饰。进一步,我们检测了 Smad4对各型AR转录活性的调控作用,发现野生型和K520R型AR在过表达Smad4后转录活性下降明显,而K386R和K386/520R型AR在过表达Smad4后转录活性无显著性变化,提示AR的K386位点是Smad4抑制AR转录活性的关键位点。从而证明Smad4通过增强AR的K386位点SUMO1修饰抑制AR的转录活性。我们又探讨了 Smad4增强AR的SUMO化修饰的可能机制。PIAS蛋白家族是重要的SUMO化修饰的E3连接酶,介导或者稳定E2结合酶与靶蛋白之间的相互作用,也是AR的SUMO化修饰的核心酶。所以,我们探讨了 Smad4对PIAS蛋白可能的招募作用。我们通过免疫共沉降实验进一步发现,Smad4对于4种PIAS蛋白家族中的三种蛋白PIAS1、PIAS2、PIAS3具有显著的招募作用,并促进其与AR和SUMO1共同形成复合物。而且通过过表达和敲除PIAS蛋白,我们证明了这种招募的意义。发现PIAS1、PIAS2、PIAS3的表达能够进一步增强Smad4对AR的SUMO1修饰的促进作用,而PIAS4则不能;敲除PIAS1、PIAS2、PIAS3能够显著抑制Smad4对AR的SUMO1修饰的促进作用。这些结果说明,Smad4招募PIAS1/2/3蛋白促进AR的SUMO1修饰。最后,我们研究了 Smad4表达水平与AR的SUMO化修饰水平之间的关联。在五种肿瘤细胞(结肠癌细胞系SW480,乳腺癌细胞系MDA-MB-231,前列腺癌细胞系PC3,乳腺癌细胞系MCF7、大肠癌细胞系HT29)中过表达AR与SUMO1,Smad4阳性表达的细胞内,AR可被SUMO1修饰,而Smad4缺失的细胞中,AR不发生SUMO化修饰,说明Smad4表达水平决定了 AR的SUMO1修饰程度。荧光素酶报告基因实验表明,在Smad4阳性表达的细胞内,AR的转录活性低,而Smad4缺失的细胞内AR的转录活性高,证明了 Smad4表达水平影响AR的SUMO化修饰水平和转录活性。综上,本论文发现了 Smad4作为新型AR修饰调控因子抑制AR的信号,阐述了 Smad4影响AR转录活性的的分子作用机制,并证明Smad4通过促进AR的SUMO1修饰从而抑制AR转录活性的细胞进程。本研究提供了前列腺癌增殖信号和分化信号之间的交叉调控的新型分子靶点,对肿瘤治疗提供了新型分子靶点和靶向。