中国大枣资源化学研究

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本论文研究工作为国家自然科学基金项目—“大枣与大戟类药材配伍减毒机理研究”和《中国药典》2010年版“大枣药材质量标准修订”项目的部分研究内容。本论文共分两章内容。第一章系统地总结了大枣种质资源、化学成分、药理效应、营养成分及质量标准的现代研究进展。第二章为大枣资源化学研究部分,共分五节,具体研究内容及结论如下:第一节中国大枣资源分布及药用大枣资源现状调查。采用文献调研及实地考查的形式,对我国大枣主要产区进行了初步调查。按照地形地貌、水文、生态环境及主栽品种差异,将我国北方枣产区初步划分为13个主要产区。并对我国药用大枣资源现状进行了调查及思考。第二节大枣化学成分研究。采用硅胶柱层析及聚酰胺柱层析等色谱技术对大枣所含化学成分进行分离、纯化,根据其理化性质及波谱数据鉴定其结构。结果从大枣的水提取物和乙醇提取物中共分离鉴定了23个化合物,其中13个为三萜酸类,分别为:大枣新酸(zizyberanal acid,1)、zizyberenalic acid(3)、ceanothenic acid(4)、ursonic acid(5)、白桦脂酸(6)、zizyberanalic acid(7)、麦珠子酸(8),熊果酸(9)、ceanothic acid(10)、epiceanothic acid(11)、齐墩果酸(12)、2α-羟基齐墩果酸(13)和2α-羟基乌苏酸(14);2个神经酰胺类:(2S,3S,4R,8E)-2-[(2’R)-2’-羟基二十四烷酰胺]-8-十八烯-1,3,4-三醇(15)和1-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2’R)-2’-羟基二十四烷酰胺]-8-十八烯-1,3,4-三醇(16);3个甾醇类:3β,6β豆甾烷-4-烯-3,6-二醇(17)、β-谷甾醇(18)和胡萝卜苷(19);2个脂肪酸类:十七烷酸(20)和二十四烷酸(21);此外尚有萘醌类(大枣萘醌,zizyberanone,2)、黄酮类(槲皮素-3-O-芸香糖苷,22)和单糖类(D-葡萄糖,23)成分。其中化合物1和2为新化合物,15和16为首次从枣属植物中分得的神经酰胺类化合物,化合物5、11、14、17、20和21为首次从该植物中分得。第三节不同品种、不同产地大枣品质评价。首次建立了一种用于同时测定大枣药材中10种三萜酸类成分(ceanothic acid,麦珠子酸,大枣新酸,zizyberanalic acid,epiceanothic acid,ceanothenic acid,白桦脂酸,齐墩果酸,ursonic acid和zizyberenalicacid)的HPLC-DAD含量测定方法。色谱条件为:采用Waters Sunfire C18(250 mm×4.6mm,5μm)色谱柱,柱温35℃,以乙腈—0.05%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL/min,化合物1-9的检测波长为205 nm,化合物10的检测波长为238 nm。所测10个化合物的工作曲线在线性范围内均表现出较好的线性相关性(r2>0.9999);其日内和日间精密度变化范围分别为0.43-1.72%和0.53-2.45%,加样回收率为94.98-104.09%。该方法成功应用于同时测定22个产地36个栽培品种共计42批大枣样品中10种三萜酸类成分含量。结果显示,不同品种、不同产地大枣三萜酸含量有较大差异,其中山东沾化产冬枣品种总三萜酸含量最高。基于样品中10种三萜酸类成分含量差异,应用系统聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)方法对样品进行区分和归类。结果显示,山东沾化产冬枣品种与其他大枣品种有较大差异,提示其亲缘关系可能较远。该方法测定的结果有助于更好地应用大枣资源,也可从植物化学分类学角度为大枣植物进行种下界定提供帮助。第四节大枣药材质量标准研究。以白桦脂酸和齐墩果酸为对照品,分别比较了不同提取溶剂、不同展开条件及不同显色方法对大枣药材薄层色谱鉴别的影响,确定了大枣药材的TLC色谱条件。首次建立了大枣药材白桦脂酸HPLC-ELSD含量测定方法。色谱条件为:采用Hypersil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,柱温25℃,以乙腈—0.1%乙酸水溶液(81:19)为流动相,流速0.4 mL/min;ELSD条件:气体压力为35 psi(2.28 slpm),漂移管温度为65℃,喷雾口温度为36℃。第五节大枣化学成分生物活性初步评价。采用MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法),对从大枣中所分离得到的11个三萜酸类成分(白桦脂酸、大枣新酸、熊果酸、epiceanothic acid、ceanothenic acid、zizyberenalic acid、麦珠子酸、ceanothic acid、zizyberanalic acid、齐墩果酸和ursonic acid)以及1个萘醌类成分(大枣萘醌)进行了体外抑制人胃癌细胞(MGC-803)、人结肠癌细胞(HT-29)、人肺癌细胞(NCI-H460)、人肝癌细胞(HepG-2)增殖活性研究。结果显示:熊果酸、zizyberenalic acid、zizyberanalicacid和齐墩果酸对上述四种肿瘤细胞株均表现出一定抑制作用。提示上述四种化学成分可以作为肿瘤细胞增殖抑制剂,或作为抗肿瘤药物先导化合物。本论文的特色和创新点为:1.以药用大枣资源品种为研究对象,采用复合色谱分离分析方法和光谱技术,从中分离鉴定了23个化合物,其中两个为未见报道的新化合物(大枣新酸和大枣萘醌),并首次在枣属植物中分离得到神经酰胺类化合物。2.采用中药资源化学的研究思路,应用HPLC-DAD结合化学计量学的方法,对我国药食两用不同产地的36个大枣栽培品种进行了系统分析评价,为客观认识和评价大枣药用资源提供了科学依据。3.按照国家药典委员会2010年版药典修订要求,对大枣药材质量标准进行了修订,建立了白桦脂酸对照品的质量标准草案,并首次建立了大枣药材的HPLC-ELSD含量测定方法,进一步加强和规范了大枣药材质量标准。
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