细胞外囊泡(extracellularvesicles,EVs)是细胞在生命活动中释放到胞外空间的一种具有生物膜结构的纳米尺寸的囊泡,广泛存在于细胞培养上清和血液、尿液、乳汁等体液中。EVs通过包裹和运输亲本细胞的蛋白质、脂质、核酸和其它生物分子,调控和影响着受体细胞的表型和功能,主要负责细胞间的物质和信息传递。EVs参与抗原呈递、血管新生、肿瘤生长与转移等生理、病理过程,在疾病诊断和治疗中显示出巨大的应用前景。EVs不仅粒径微小、携载的蛋白、核酸等“货物分子”含量极低,而且因来源细胞、细胞状态以及分泌途径的不同使其在尺寸和内含物等方面存在高度的个体差异性和多样性,如何在单颗粒水平对EVs进行物理和生化性质的同时精准测量是一个亟需解决的科学难题。电子显微镜等依赖于显微成像的技术虽可直观地对EVs的形态、粒径等物理性质进行表征,但是存在样品制备繁琐、分析速度慢等不足。纳米颗粒跟踪分析技术和可调电阻脉冲传感技术常被应用于EVs粒径和浓度的快速测定,但分辨率低且难以实现EVs生化性质的测定。传统的生物化学分析检测方法如蛋白质免疫印迹法(westernblotting,WB)、酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和 PCR 扩增法等均是对众多EVs的集权平均分析,无法揭示EVs的个体异质性。流式细胞术是一种通过散射和多色荧光信号对悬液中的细胞或细胞大小的颗粒在单颗粒水平高通量、多参数的检测技术,散射光可以揭示细胞或颗粒的粒径以及材质的疏密程度,多色荧光标记可以实现细胞内基因表达、特异性蛋白表达、酶活、离子浓度等生化性状的测定。然而,由于灵敏度的限制,传统的流式细胞仪难以检测粒径小于300～500 nm的EVs。结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术,本课题组首创性地研制成功国际上最灵敏的纳米流式检测装置(nano-flow cytometer,nFCM),将病毒、二氧化硅纳米颗粒和纳米金颗粒的单颗粒散射检测下限分别推进到前所未有的27nm、24nm和7nm,较传统流式细胞术的散射检测灵敏度提升了 4-6个数量级。基于nFCM高灵敏、多参数检测的特性,本论文发展了一种在单颗粒水平对EVs进行快速检测的分析方法,实现了对粒径低至40 nm的EVs的多参数定量表征。纳米流式检测技术使得研究人员可以像传统流式细胞仪分析细胞那样对EVs进行分析表征。本论文主要包括以下内容:第一章为文献综述。主要介绍了 EVs的主要功能和重要应用以及EVs的表征技术,并阐述了本论文的选题思路和研究内容。第二章为细胞外囊泡的无标记散射光分析方法的构建。基于Triton X-100表面活性剂可对脂膜结构的囊泡进行裂解,而蛋白等颗粒则不会受到影响的特点,利用nFCM通过单颗粒计数测定EVs样本裂解前后的颗粒浓度,建立了 EVs样本纯度的定量表征方法。选用一系列粒径已知、单分散性良好的二氧化硅纳米颗粒(silica nanoparticles,SiNPs)建立颗粒的散射光强度与粒径的标准工作曲线,并结合米氏散射理论对于因SiNPs和囊泡的折射率不同所引起的散射光强度的差异进行校正,实现EVs样本粒径分布的准确测定。nFCM的分析速率高达每分钟10,000个颗粒,仅需几分钟即可获得具有高度统计代表性的EVs粒径分布特征,分辨率和准确性媲美冷冻透射电镜。第三章为细胞外囊泡的散射光和荧光的多参数分析方法的构建。EVs运载有亲本细胞的脂质、核酸、蛋白和其他生物化学分子,在疾病诊断和治疗中具有极大的应用潜力。基于nFCM散射光和荧光同时检测的性能,结合荧光标记策略,可实现单个EVs的物理和生物化学性质的检测分析。磷脂双分子层膜是EVs的主要构成部分和共有的结构特征,采用脂膜标记策略,本论文测定了多种亲脂探针对EVs的标记效率;结合核酸染料标记,对单个EVs中核酸含量的分布进行了测定;利用点击化学和唾液酸糖代谢标记,实现了 EVs表面唾液酸糖的分析;结合免疫荧光标记,测定了表达特定一种或者两种表面蛋白的EVs 比率,并对单个EVs表面特定蛋白的拷贝数及其分布进行了测定。第四章为临床血液样本中细胞外囊泡多参数检测方法的构建。由于nFCM在样本检测过程中,样品流直径远小于激光光斑的直径,保证了颗粒在经过探测区时的检测效率接近100%。基于单颗粒计数和免疫荧光标记策略,实现了血浆中表达不同表面蛋白EVs的检测,并对其在血浆中的绝对浓度进行标定。通过对50μL血浆中CD147阳性EVs的颗粒浓度测定,建立了结直肠癌的早期诊断(P<0.001)和预后分析(P<0.05)的表征方法。所发展的分析方法将为EVs的基础研究和临床应用提供先进的技术手段。第五章为总结与展望。总结本论文的研究内容,并对后续可进一步开展的研究工作进行展望。