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目的研究锌对胰岛素抵抗状态下HepG2细胞糖代谢影响及胰岛素传导PI3K-AKT信号通路中关键靶点的影响,为揭示锌与胰岛素抵抗之间的关系提供实验依据。方法采用不同浓度(10-7、5 ×10-7、10-6、5 ×10-6 10-5、5 ×10-5mol/L)的胰岛素诱导HepG2细胞24h,建立胰岛素抵抗模型并对模型进行鉴定。选择适宜浓度建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,用不同浓度的锌进行干预。采用葡萄糖氧化酶法检测细胞葡萄糖消耗量,肝糖试剂盒检测细胞内糖原含量,观察不同浓度锌干预后HepG2细胞葡萄糖消耗量及细胞内糖原含量的改变,研究锌对HepG2细胞糖代谢能力的影响。采用蛋白印迹法(Western-Blot)检测胰岛素信号传导通路中关键靶点胰岛素受体β亚单位酪氨酸磷酸(pY-IRβ)蛋白、激酶B(Protein kinase B,AKT/PKB)、糖原合成酶激酶(Glycogen synthase kinase,GSK)磷酸化情况。结果不同浓度(10-7、5×10-7、10-6、5×10-6、10-5、5×10-5mol/L)的胰岛素诱导 HepG2细胞24h,细胞葡萄糖消耗量有不同程度的减少,且差异具有统计学意义(P<0.05)。当胰岛素浓度为10-6 mol/L时,葡萄糖消耗量最少,故选择该浓度为建立胰岛素抵抗模型浓度。锌对细胞葡萄糖摄取量的影响:分别以20、50、100、200μmol/L的锌单独作用/与胰岛素共同作用于正常细胞和胰岛素抵抗细胞,结果显示,对于正常细胞或胰岛素抵抗细胞均呈现出一定的剂量反应关系,以100、200μmol/L的锌作用效果较为明显,其单独作用的效果虽然明显低于胰岛素的效果,但已呈现出一定的胰岛素样作用,特别是与胰岛素共同作用时的效果分别高于胰岛素或相同剂量锌的单独作用效果。20、50μmol/L的锌对胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗量未见明显的影响,但50μmol/L的锌与胰岛素共同作用对正常细胞葡萄糖消耗已显现出明显的增加趋势。锌对细胞糖原含量的影响:基础状态下,100、20μmol/L的锌作用于胰岛素抵抗模型细胞能够使细胞内糖原含量明显高于正常对照组和模型对照组细胞(P<0.05);200μmol/L的锌与胰岛素共同作用,效果分别高于胰岛素或相同剂量锌的单独作用(P<0.05)。锌对PI3K-AKT信号通路中关键靶点磷酸化的影响:基础状态下的胰岛素刺激可使正常细胞和胰岛素抵抗细胞pY-IRβ、pAKT Ser473、pGSK 3βSer9的表达水平升高,但胰岛素抵抗细胞的上升幅度明显低于正常细胞,说明胰岛素抵抗细胞对胰岛素刺激的敏感性下降。基础状态下锌单独作用于胰岛素抵抗细胞时,100、200μmol/L 的剂量使 pY-IRβ、pAKTSer473、pGSK 3βSer9 的表达水平较模型对照组略有上升,但明显低于胰岛素的作用效果;200μmol/L的锌与胰岛素共同干预模型细胞,pY-IRβ、pAKTSer473、pGSK 3βSer9的表达水平均升高(P<0.05),其效果分别高于胰岛素或相同剂量锌的单独作用。阻断PI3K后锌对PI3K-AKT信号通路中关键靶点磷酸化的影响:未加入Wortmannin 时,胰岛素和锌均能够增加pY-IRβ、pAKTSer473、pGSK 3βSer9的表达水平。加入PI3K抑制剂Wortmannin后,锌作用后的pAKTSer473、pGSK 3βSer9的表达水平明显受到抑制,表明锌对AKT、GSK的磷酸化的影响是通过信号通路级联反应关系实现的,而不是直接作用的结果。结论本实验采用高浓度胰岛素(10-6 mol/L)干预HepG2细胞24h,建立胰岛素抵抗模型。100、200μmol/L的锌能够改善基础状态下胰岛素抵抗细胞的糖代谢能力,使细胞葡萄糖消耗量增加,细胞内糖原含量增加;当胰岛素与锌共同作用时,锌能够呈现出一定的增强胰岛素作用的效果。100、200μmol/L的锌对于胰岛素抵抗的HepG2细胞时表现出一定的胰岛素样作用,可上调胰岛素抵抗细胞pY-IRβ、AKT Ser473、GSK 3βSer9的磷酸化水平,这可能是锌改善胰岛素抵抗的HepG2细胞糖代谢能力的分子机制之一。锌对胰岛素抵抗的HepG2细胞AKT、GSK的磷酸化的影响是通过IR-PI3K-AKT信号通路级联反应关系实现的,而不是直接作用的结果。