【研究背景】特发性面神经麻痹的初始病因尚不清楚[1]，但是解剖学研究[2]和临床面神经减压手术[3]中的发现都提示面神经的缺血水肿致骨性管腔的卡压是导致神经变性坏死的直接原因，并且面神经水肿持续时间、肿胀程度与预后呈负相关[4]。穿行于面神经管中的面神经颞骨部是神经水肿卡压最严重的节段[5]。虽然许多基于形态学和力学的研究都证实，面神经麻痹过程中面神经管内的神经水肿和高压状态的存在[6]，但是关于其致病机制的研究，尚局限于炎性水肿反应和缺血再灌注损伤机制的方面，对于水肿形成和持续的机制尚无针对性的研究[7]。反映在临床治疗上，对于早期面神经麻痹患者往往采用打开面神经骨管的面神经减压和减轻炎症反应的激素治疗为主[8]。但是这些方法不仅治疗效果有限，而且创伤较大，影响康复的因素较多。有文献报道，症状超过3周未缓解的特发性面瘫患者，40%以上会遗留永久性后遗症[9]。因此，更简便有效针对面神经水肿的治疗方法亟待探索。近年研究发现，水通道蛋白（Aquaporin，AQP）介导了生物体的大部分水转运，是维持体内正常水代谢的关键膜蛋白[10]。一旦其分布和功能出现异常，往往导致局部或全身水代谢紊乱，出现相关疾病[11]。对于脑水肿等神经系统的水代谢疾病，近年来的研究热点集中于不同水通道蛋白亚型的分布和功能研究[12]。周围神经系统结构和功能，与中枢神经系统差异很大，水通道蛋白的分布也不尽相同，这一点从周围神经系统仅有的水通道蛋白研究已得到证实[13]。本课题组前期研究通过筛选发现了AQP1在面神经上大量分布，但水通道蛋白的组织细胞定位与作用尚无研究。本课题着重研究的是：水通道蛋白1在面神经麻痹神经水肿中起了何种作用，能否通过调节AQP1表达来控制和减轻水肿的发生，从而减轻面神经变性和坏死，最终改善面神经麻痹患者的预后。【目的】（1）显微解剖结合冰冻切片观察，确定面神经颞骨部解剖学特征和组织切片表现，为研究面神经迷路段膝状神经节部位的神经水肿奠定基础；（2）采用多重免疫荧光双标染色等方法，对AQP1在面神经组织细胞定位和全长分布进行检测；（3）采用HSV-1病毒接种诱导BALB/c小鼠出现急性面神经麻痹，并通过行为学评分和面神经核团切片计数评估模型特征，为后续实验提供稳定和可控的动物模型；（4）运用多重免疫荧光双标染色、RT-PCR和Western Blot等方法，对HSV-1诱导面神经麻痹后不同时间点面神经迷路段膝状神经节神经水肿程度和对应的AQP1变化情况进行检测，探讨AQP1与面神经水肿的相互关系；（5）通过面神经雪旺氏细胞的体外培养、鉴定和免疫荧光技术，验证AQP1的细胞定位，并为将来进行AQP1与雪旺氏细胞水肿机制研究奠定基础。【方法】（一）AQP1在面神经管内的组织细胞定位与分布1、将15只BALB/c小鼠（4周龄，雌性，16~18克）随机分为A组、B组和C组，每组5只；2、A组进行面神经管内神经走行和周围结构的显微解剖研究，了解BALB/c小鼠面神经颅内段的详细走行和各段形态，确定面神经迷路段膝状神经节的位置；3、B组小鼠麻醉后脱颈处死，行灌注、固定，取完整头颅，去除皮肤和部分软组织。标本经脱钙后行冠状位连续冰冻切片，到面神经管段后，取相邻2张切片，分别融贴于两张玻片，形成I、II两套切片。I套切片行甲苯胺蓝染色，光镜观察，寻找各节段对应的切片表现，明确面神经膝状神经节切片定位；4、II套切片行AQP1、S-100、IB-4和Hoechst多重荧光双标染色，确定AQP1在面神经全长的组织细胞定位和表达分布；5、C组5只BALB/c小鼠（4周龄，雌性，16~18克）麻醉后脱颈处死，取其面神经颞骨部进行细胞培养，至细胞铺满培养皿底板，行AQP1、S-100和Hoechst多重免疫双标，进一步验证AQP1在面神经上的细胞定位。（二）HSV-1诱导急性面神经麻痹模型的构建、改进和评估1、采用5只BALB/c小鼠（4周龄，雌性，16~18克），研究BALB/c小鼠面神经出茎乳孔后耳后支走行，分布范围及毗邻结构，为改进模型制备方法提供依据；2、将30只BALB/c小鼠（4周龄，雌性，16~18克）随机分为实验组I，实验组II及对照组，每组10只，以左侧为实验侧。实验组I将25μl滴度为6.7×107PFU/ml的HSV-1kos株病毒液种植于左侧耳后乳突部皮肤，实验组II以等量滴度为9.5×106PFU/ml病毒液替代，对照组以等量病毒培养液代替；3、病毒接种后每天定时对三组小鼠进行面神经功能行为学评分，分析数据，对比各组小鼠的面神经功能、面瘫发生率、症状出现、持续时间和死亡率等，寻找更稳定可靠的模型制备方法；4、病毒接种操作后第28天，各组小鼠处死后进行面神经核团计数。灌注固定后，对核团所在脑区行连续冰冻切片，每5张取1张，切片以神经核抗体行荧光染色并计数，得出每只动物面神经元总数，对组间和组内实验侧与对照侧神经元总数进行student-t检验和单因素方差分析，取P＜0.05为有显著性差异。（三）HSV-1诱导面瘫后面神经迷路段膝状神经节AQP1的表达变化及与神经水肿的关系1、将52只BALB/c小鼠（4周龄，雌性，16~18克）随机分为O1、O2、A1、A2、B1、B2和C1、C2组。O1和O2各5只，其余6组每组7只。按第一阶段方法制备急性面神经麻痹模型。分别在不同时间点处死，O1和O2组为病毒种植即刻，A1和A2组为病毒种植后第9天，B1和B2组为病毒种植后第16天，C1和C2组为病毒种植后第40天。O1、A1、B1和C1组处死后取全头颅行灌注、固定和脱钙，而后行冠状位连续冰冻切片。每只小鼠取面神经迷路段膝状神经节周围切片进行比较。相邻2张切片分别保存形成I和II两套切片；2、I套切片行甲苯胺蓝染色，测量迷路段膝状神经节处面神经与面神经管截面积比值（FN/FC），并行统计分析，确定HSV-1诱导面瘫后各时间点面神经管内面神经水肿程度；3、II套切片行AQP1和Hoechst荧光双标染色，确定HSV-1诱导面瘫后各时间点面神经管内AQP1表达。并与神经水肿变化趋势进行比较；4、将上述实验的O2、A2、B2和C2组小鼠（4周龄，雌性，16~18克）根据不同时间点脱颈处死，迅速打开面神经管获取面神经颞骨部组织在液氮中进行组织匀浆后分为两等份，一份用于Western Blot，另一份用于RT-PCR；5、采用Western Blot法对各组面神经颞骨部组织内的AQP1表达进行检测，并对结果进行统计学检验，确定AQP1蛋白水平的时相性变化趋势；6、采用RT-PCR法对各组面神经颞骨部组织内的AQP1mRNA的表达进行检测，并对结果进行统计学检验，明确AQP1基因表达水平的时相性变化趋势。【结果】（1）采用多重免疫荧光双标和细胞培养鉴定等技术方法，首次明确了AQP1在面神经颞骨部的组织分布和细胞定位：AQP1分布于面神经颞骨部的神经组织和神经滋养血管中，定位于雪旺氏细胞、血管内皮细胞及神经外膜。AQP1所在的雪旺氏细胞包绕神经纤维形成髓鞘。在面神经颞骨部各段上AQP1的分布并无明显差异。在面神经起始段，存在AQP4和AQP1分布的交界线。中枢段仅有AQP4分布，外周段则仅有AQP1分布。这个交界线与面神经的中枢神经和外周神经交界线重合，与星形胶质细胞和雪旺氏细胞的分布交替相对应。体外的面神经雪旺氏细胞培养鉴定也证实了AQP1在雪旺氏细胞的分布。（2）通过对面神经颅外段耳后支的解剖学研究，采用搔刮耳后乳突部皮肤，接种高低两个滴度的HSV-1kos株病毒液，分别成功构建了急性可复性小鼠面神经麻痹模型，通过对比发现：低滴度病毒制作的模型在存活率和致面瘫率都高于既往文献方法，且对病程及核团凋亡率无影响。（3）通过对面神经管的显微解剖和连续切片观察，明确了面神经管迷路段膝状神经节的解剖走行和组织切片定位；通过测量面神经管迷路段膝状神经节的FN/FC比值，了解小鼠急性面神经麻痹模型术后不同时间点的面神经管内神经水肿程度；通过对比分析发现，HSV-1诱导急性面神经麻痹模型中面神经管内神经水肿于病毒接种后第9天时达到峰值，随后逐渐消退，至第16天时仍高于正常水平，至接种后第40天恢复正常水平。（4）通过对AQP1在面神经颞骨部迷路段膝状神经节的免疫荧光观察发现，其亮度在HSV-1诱导急性可复性面神经麻痹模型病程中呈现时相性变化，症状出现时为最高峰，随着症状的缓解和消失逐渐降低。但是在症状完全恢复之后的3周其表达水平才大致正常。（5）通过对病毒种植后各时间点的面神经颞骨部Western Blot检测的结果分析发现，面神经组织内的AQP1蛋白水平于病毒种植后第9天最高，随后逐渐降低，在第16天仍高于正常，缓慢降低至第40天大致恢复正常。（6）采用RT-PCR的技术，对HSV-1病毒种植后不同时间点的面神经颞骨部AQP1mRNA水平进行检测，发现其呈现与Western Blot检测结果类似的时相性变化（病毒种植后第9天为峰值，随后逐渐下降）。【结论】（1）验证了HSV-1kos株病毒接种于面神经耳后支分布范围可以诱发BALB/c小鼠出现急性可复性面神经麻痹。通过调整病毒滴度，精确选择种植范围，可以很好的降低致死率，并获得更高的致面瘫率。该模型是研究急性特发性面神经麻痹的理想工具。（2）对面神经颞骨部解剖和组织切片的对比，明确了迷路段膝状神经节的切片定位，为今后相关研究奠定了基础。（3）明确了AQP1在面神经颞骨部的组织分布和细胞定位，并发现在急性面神经麻痹模型中，AQP1的表达变化与面神经管内神经水肿程度的变化趋势相一致，提示其与面神经管内神经水肿关系密切。（4）体外细胞培养，进一步证实了AQP1在雪旺氏细胞的表达，并为今后深入研究AQP1调节机制奠定了基础。