论文部分内容阅读
第一部分Maspin基因在脐静脉内皮细胞中表达的研究目的研究正常及缺氧环境下maspin基因在脐静脉内皮细胞株中的表达情况。方法利用化学物质二氯化钴(Cobalt(Ⅱ) chloride, CoCl2)构建细胞缺氧环境,依次采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)和巢式PCR (Nest-PCR)的方法检测脐静脉内皮细胞株中maspin的mRNA表达情况,并采用蛋白印迹法(Western Blotting)检测正常及缺氧环境下maspin的蛋白表达情况。结果1.RT-PCR的结果显示,正常及缺氧条件下,maspin mRNA有微量表达。2.巢式PCR及琼脂糖凝胶电泳的结果显示,在196bp处见到明显的条带,提示正常及缺氧条件下,脐静脉内皮细胞中有微量mRNA的表达。3. Western blotting结果显示,正常及缺氧环境下,脐静脉内皮细胞株中均未见到明显的maspin蛋白条带。结论无论在正常或缺氧条件下,我们只能发现maspin在脐静脉内皮细胞株微量的mRNA表达,但无法检测到maspin蛋白的表达。我们认为脐静脉内皮细胞株中几乎没有maspin基因的表达。第二部分外源性重组人maspin蛋白对脐静脉内皮细胞功能的影响目的研究正常及缺氧环境下外源性重组人maspin蛋白对脐静脉内皮细胞功能的影响。方法分别在正常及缺氧环境下,使用3种不同浓度的重组人maspin蛋白(r-maspin)处理脐静脉内皮细胞。分别使用CCK8试剂盒、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、划痕实验、小管形成实验及一氧化氮(NO)试剂盒检测脐静脉内皮细胞的增殖、凋亡、迁移、管形成及一氧化氮的合成。结果1.正常氧环境下,脐静脉内皮细胞保持72小时持续增殖的趋势。然而,缺氧环境下,脐静脉内皮细胞的增殖受到显著抑制。正常氧环境下,r-maspin明显促进脐静脉内皮细胞的增殖,在处理的48小时后,促增殖的趋势达到高峰；低氧环境下,仅高浓度r-maspin可明显促进脐静脉内皮细胞的增殖。2.与正常氧环境相比,缺氧环境下脐静脉内皮细胞的凋亡无明显变化。正常氧环境及缺氧环境下,r-maspin对脐静脉内皮细胞均无明显的促凋亡作用。3.正常氧环境下,脐静脉内皮细胞间划痕的宽度随着时间的延长而逐渐变窄;而缺氧环境下,划痕的宽度随着时间的延长未发生明显变化,提示缺氧明显抑制脐静脉内皮细胞的迁移能力。正常及缺氧环境下,r-maspin处理脐静脉内皮细胞后,随着时间的延长,细胞间划痕的宽度均未发生明显改变,提示脐静脉内皮细胞没有发生明显的迁移。4.管形成实验的结果显示：与正常对照组相比,缺氧环境下,脐静脉内皮细胞明显聚集成团,形成的管腔直径较小,但管腔数量几乎是正常对照组的3倍。正常环境下,不同浓度r-maspin处理后,HUVECs形成的管腔直径较对照组缩窄了50%,管腔数量增加2倍。缺氧环境下,r-masp in也能够明显抑制HUVECs的管形成。高浓度r-maspin处理后,脐静脉内皮细胞几乎不能形成完整的管腔,仅能形成不完整的管腔分支。5.与正常对照组相比,缺氧环境下脐静脉内皮细胞内合成的一氧化氮减少了50%(84.84±12.32 vs.171.3±6.332,P<0.01)。正常环境下,r-maspin处理后,脐静脉内皮细胞内合成的一氧化氮显著的减少。缺氧环境下,r-maspin也可使一氧化氮的合成明显的减少,但是,差异没有显著的统计学意义。结论R-maspin蛋白明显促进HUVECs的增殖,同时抑制H UVECs的一氧化氮的合成和管形成能力,导致增多的狭窄管腔的形成,但是对HUVEC s的凋亡和迁移能力无明显影响。这些结果证明外源性重组人maspin蛋白调控脐静脉内皮细胞的生物学功能。第三部分Maspin调控脐静脉内皮细胞功能的分子机制研究目的探讨maspin调控脐静脉内皮细胞功能的分子机制。方法分别在正常及缺氧环境下,使用3种不同浓度的重组人maspin蛋白(r-maspin)处理脐静脉内皮细胞。分别采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及蛋白质印迹法(Western Blotting)检测脐静脉内皮细胞内MMP2的mRNA及蛋白表达情况,采用明胶酶谱法检测脐静脉内皮细胞内MMP2的活性。结果1.与正常对照组相比,缺氧环境下MMP2的mRNA表达水平无明显改变；正常氧环境下,MMP2的蛋白表达水平随着r-maspin浓度的升高而升高,高浓度r-maspin显著促进MMP2的蛋白表达；与之相反,缺氧环境下,MMP2的蛋白表达水平随着r-maspin浓度的升高而降低,高浓度r-maspin显著抑制MMP2的蛋白表达。2.明胶酶谱的结果显示：正常氧环境下,活性的MMP2 (63-KD)和MMP2的前体形式(72-KD)均有表达;而缺氧环境下,只能检测到MMP2的前体形式(72-KD)。正常氧环境下,高浓度r-maspin存在时只有72-KD形式的MMP2存在。结论无论正常氧环境或缺氧环境下,r-maspin均不影响MMP2的mRNA表达。高浓度r-maspin在正常氧环境下明显促进MMP2的蛋白表达,而在缺氧环境下明显抑制MMP2的蛋白表达。正常氧环境下,r-maspin抑制MMP2的活性,缺氧可直接抑制MMP2的活性。这些结果说明maspin可通过改变MMP2的表达和活性而影响脐静脉内皮细胞的功能。