论文部分内容阅读
目的:主要探讨PD模型中HtrA2/Omi功能异常与DA神经元凋亡、内质网应激及Wnt信号通路相关性的分子机制,并评估干预HtrA2/Omi、Wnt、GSK3β等分子靶点的神经保护作用。方法:1.采用6羟基多巴胺(6-OHDA)干预PC12细胞,构建PD细胞损伤模型,观察6-OHDA诱导下细胞形态学变化。CCK8法检测细胞活力,筛选最佳造模浓度。免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。流式细胞法检测细胞的凋亡率。利用Western Blot免疫印迹(WB)技术检测内质网应激及凋亡相关蛋白α-syn、CHOP、Grp78、active caspase3、XIAP和TH等蛋白水平的改变。siRNA慢病毒转染沉默HtrA2/Omi基因,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测沉默效率。WB法检测细胞内质网应激、凋亡蛋白、Wnt通路蛋白。2.CCK8法筛选Ucf101(HtrA2/Omi的特异抑制剂)的最佳浓度。WB法检测Ucf101对PD模型细胞的内质网应激的影响;采用脑立体定位技术右侧黑质致密部(SNc)和中脑腹侧被盖(VTA)两点注射6-OHDA法,建造PD大鼠模型。分别于术后2周、3周、4周腹腔注射阿扑吗啡(APO),诱导动物的旋转行为。WB法检测HtrA2/Omi、activate Caspase3、α-syn,内质网应激、凋亡相关蛋白等蛋白的表达。Ucf101持续干预大鼠4周,观察大鼠的行为,免疫组织化学检测中脑组织TH的表达。WB法检测大鼠中脑组织HtrA2/Omi、TH表达、内质网应激、凋亡相关蛋白及Wnt通路蛋白的表达。3.WB法分析PD细胞模型的Wnt通路蛋白的表达;CCK8法筛选最佳的Wnt1蛋白浓度,流式细胞术检测Wnt1蛋白对PD模型细胞凋亡的影响,WB法检测内质网应激相关蛋白的表达;CCK8法筛选最佳的LiCL(GSK3β特异抑制剂)浓度,免疫荧光法检测细胞TH、Wnt1的表达。结果:1.细胞存活率与6-OHDA呈时间剂量依赖性下降的趋势,60μM时细胞的存活率为51.37±2.83%,选择60μM作为6-OHDA-PD细胞模型的造模浓度。PD模型细胞0-24h HtrA2/Omi表达呈升高趋势。与对照组比较,α-syn、Bip/Grp78、CHOP、active caspase3的表达上调,P<0.05;凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达下调,P<0.05,模型组的凋亡率明显升高。沉默HtrA2/Omi基因,HtrA2/Omi mRNA的表达明显下降,P<0.05。与模型细胞组比较,HtrA2/Omi基因沉默组细胞凋亡率升高,α-syn、Bip/Grp78、CHOP、active caspase3的表达上调,P<0.05;凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达下调,P<0.05,加剧了6-OHDA对细胞的内质网应激损伤。GSK3β磷酸化分子tyr216/Ser9比值升高,Wnt通路受抑制。2.Ucf101的干预浓度,2.5uM使细胞活力明显升高,10uM、20uM均使模型细胞活力下降,P<0.05。2.5uM Ucf101可降低模型细胞的凋亡率,10uM Ucf101可加剧模型细胞的凋亡。2.5uM Ucf101预处理PD模型细胞,内质网应激标志分子Bip/Grp78和CHOP的表达下降,P<0.05;Ucf101可改善PD大鼠APO诱导的旋转行为,中脑TH表达增加。Ucf101减少PD大鼠中脑α-syn的积聚,降低ERS水平,下调caspase3,上调TH和XIAP,保护DA神经元。PD大鼠的Wnt-3α、β-catenin下调,p-GSK3β(ser9)/p-GSK3β(tyr216)的比率降低。Ucf101上调PD大鼠的Wnt-3α、β-catenin和p-GSK3β(ser9),下调p-GSK3β(tyr216)。Ucf101激活PD大鼠DA神经元的Wnt通路,降低GSK3β的活性,保护DA神经元。3.PD模型细胞24h内的p-GSK3β(ser9)、β-catenin、p-Akt的表达呈下降趋势,p-GSK3β(Tyr216)的表达呈上升趋势。6-OHDA抑制了Wnt通路的激活,升高GSK3β的活性。CCK8法筛选Wnt1的最佳浓度为100ng/mL,Wnt1使PD模型细胞的Bip/Grp78和CHOP的表达明显降低。Wnt1可减缓6-OHDA所致的内质网应激及凋亡。LiCL的最佳浓度为2mM,LiCl可使模型细胞的存活率增高,上调Wnt和TH的表达,激活了Wnt信号通路,减轻6-OHDA导致的细胞损伤。结论:1.6-OHDA使体内和体外PD模型上调α-syn、HtrA2/Omi、ER应激及凋亡相关蛋白,抑制Wnt通路,激活GSK3β,促进DA神经元凋亡;2.沉默HtrA2/Omi基因可加剧PD模型细胞的ER应激及凋亡,进一步抑制Wnt通路,激活GSK3β,加重细胞损伤;3.轻度抑制HtrA2/Omi能缓解6-OHDA所致的ER应激,减轻DA神经元的凋亡,激活Wnt通路,抑制GSK3β,具有一定的神经保护价值;4.Wnt1缓解PD模型细胞的ERS,减少细胞凋亡;LiCl下调模型细胞的ERS,减少细胞凋亡,抑制GSK3β,激活Wnt通路,具有一定的神经修复价值;5.证明HtrA2/Omi功能异常与ERS在PD发病机制中可能发挥重要作用,Wnt通路及Wnt、GSK3β等分子在细胞凋亡的级联反应中起关键作用,可能作为PD研究及治疗的靶点。