布鲁氏菌病是一种人兽共患病，该病不但严重影响养殖业的发展，对人类健康也构成巨大威胁。人畜布鲁氏菌病难以防控的原因是多方面的，其中，其致病机理（包括胞内寄生机理）不清、免疫机理不清是主要原因。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是布鲁氏菌主要的毒力因子，也是引起哺乳动物免疫的主要抗原之一。目前布鲁氏菌LPS合成的途径并不完全清晰，已经发现的与布鲁氏菌LPS合成相关的关键基因有wbkA、gmd、wzm、wzt、wbkB、wbkC等基因，其中wzm、wzt基因既是LPS合成的关键基因，又是ABC转运系统的主要组成部分。ABC transporter（ABC转运系统）在细菌中是一个主要的细胞转运机器，由一系列同源基因编码的操纵子组成。该操纵子由ATP结合蛋白，膜蛋白，亚基结合蛋白3部分组成，通常情况下，形成由6个跨膜片段组成的2个完整的膜蛋白。ABC转运系统是膜外生物大分子合成的主要运输通道之一，参与胞外多糖的合成。此外，ABC转运系统在细菌营养成分的运输，毒力分子的外排等过程中也起着重要的作用。然而ABC转运系统对细菌毒力、免疫原性及蛋白质表达的影响还不清楚。本研究通过构建致死质粒，利用基因重组的方法敲除LPS合成的关键基因wzm和wzt基因部分序列，构建LPS缺失的突变株，研究突变株感染小鼠后的脾菌数，评价其毒力，并对其血清抗体水平、细胞因子水平、淋巴细胞增殖与转化差异进行了比较，通过2D电泳比较其蛋白质组的差异，研究基因缺失对菌株毒力及免疫原性的影响，比较其缺失前后的蛋白质组的变化，分析基因缺失对菌体基因表达的影响，为进一步揭示布鲁氏菌的致病机理、免疫机制提供实验依据，也可为布鲁氏菌粗糙型疫苗的研制奠定基础。实验结果如下：1.本实验成功构建了wzm和wzt基因敲除的重组质粒，经PCR扩增和酶切鉴定，该质粒包含sacB基因反向筛选标记，wzmf/wztf和wzmr/wztr目的基因两臂片段。通过电转化将重组质粒转入布鲁氏菌B. abortus S19，经kanr抗性，5%蔗糖TSB琼脂固体培养基筛选，经过PCR扩增和测序鉴定突变位点正确，经测序证明Δwzm和Δwzt分别缺失了511bp和446bp。将鉴定的阳性突变株Δwzm和Δwzt进行特异性引物PCR鉴定结果显示为布鲁氏菌，两株突变株的LPS粗提物进行SDS-PAGE鉴定结果表明突变株LPS-O侧链缺失，吖啶橙凝集反应和感染血清的虎红平板试验证明突变株O抗原缺失，表现为粗糙型。2.通过感染小鼠试验发现，感染8周后，亲本株S19，突变株Δwzm和Δwzt的log脾菌数分别为4.11±0.31，2.86±0.52，2.52±0.41，突变株Δwzm和Δwzt较亲本株S19感染小鼠后的脾菌数显著下降，脾指数分别为1.30±0.23，0.67±0.12，0.62±0.52，与亲本株相比脾指数显著下降，说明wzm/wzt基因缺失会造成毒力下降。3.免疫小鼠后，通过淋巴细胞增殖、淋巴细胞转化实验发现，Δwzm和Δwzt突变株引起的淋巴细胞转化CD4+/CD8+比值较亲本株S19要高，但是CD3+淋巴细胞数较亲本株降低，淋巴细胞增殖指数也较亲本株下降显著。通过ELISA检测血清中IgG抗体水平结果显示，Δwzm和Δwzt突变株免疫小鼠产生的抗体水平较S19亲本株要高，而且抗体持续时间较长。对免疫后小鼠的脾细胞体外培养诱导产生IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-、NO均表现不同程度的下降，Δwzt比Δwzm突变株诱导产生的IFN-γ无论是细胞水平，还是体液水平比亲本株都要低。4.研究表明wzm和wzt基因缺失均使2,3-二磷酸甘油酸依赖型磷酸甘油酸变位酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶的羧基转移酶亚基、50S核糖体组成蛋白L9、磷酸甲基嘧啶激酶、ATP/GTP结合蛋白、ABC转运单位底物结合蛋白等8个代谢相关蛋白的表达下调。此外wzm基因缺失造成核苷二磷酸激酶、果糖-2-磷酸醛缩酶、3-羟基丁酰CoA脱氢酶、核糖体循环因子、硫胺素-磷酸焦磷酸化酶、硫代甘氨酸氧化酶等6蛋白表达量下降，同时引起噻唑合成酶、钼酸盐转运蛋白、双组分系统效应调节蛋白、孔蛋白Omp2b、6,7-二甲基-8-ribityllumazine合成酶等6个蛋白表达量上调。wzt基因缺失造成6-磷酸-葡萄糖酸内酯酶、电子转移黄素蛋白亚基、饥饿蛋白、超氧化物歧化酶、50S核糖体组成蛋白L25、NAD(P)H还原酶、蛋白输出蛋白secB、ATP依赖的Clp蛋白酶水解亚单位、双精氨酸转运途径的信号序列结构域蛋白等8个基因表达下调，同时引起TAXI家族TRAP转运受体、铁硫ATP酶SufC、辅酶Q-细胞色素C还原酶FeS亚基、延伸因子Ts等4个蛋白表达上调。上述研究结果表明，布鲁氏菌wzm和wzt基因缺失产生了粗糙型突变株，进一步说明wzm和wzt基因与细菌LPS-O侧链的合成有关，两个突变菌株对小鼠的毒力较亲本株降低，揭示wzm和wzt基因通过影响LPS合成从而影响细菌毒力。两个突变株均能诱导产生比亲本株高的抗体效价，但是细胞免疫水平下降，说明wzm和wzt基因缺失均增强细胞免疫的同时抑制了体液免疫。比较蛋白质组学研究发现，wzm和wzt基因缺失均影响多种蛋白质的表达以下调为主，他们影响蛋白质表达调控的机制有待于进一步研究。