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目的本实验研究模型均采用体外培养的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞,探讨布比卡因(bupivacaine,bup)的神经毒性以及单唾液酸四己糖神经节甘脂(gangliosides,GM-1)预处理后对布比卡因诱导的细胞神经毒性时的保护作用及可能作用机制。为其应用于神经保护及今后临床上药物防治布比卡因引起的潜在神经毒性提供一定的理论依据和实验数据,寻求更为有效的治疗方法。方法:所有试验均采用小鼠神经母细胞瘤细胞N2a细胞作为研究对象。(一)实验分组:(1)实验一:将细胞分为下述几组:对照组(C组):N2a细胞不进行任何干预,布比卡因为0μmol/L;布比卡因组,N2a细胞与不同浓度布比卡因 600、900、1200、1500、2000μmol/L (B1、B2、B3、B4、B5 组)作用。(2)实验二:将细胞分为下列几组:对照组(A组):无布比卡因损伤及GM-1干预;布比卡因组(B组):布比卡因有效损伤浓度和24h前无GM-1保护;不同浓度的GM-1预保护组(BG组):在布比卡因有效损伤浓度前24h预先在培养液中加入不同浓度GM-1 0.001、0.01、0. 1、1、10μmol/L(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5 组)。(二)实验一:通过观察不同浓度的布比卡因对N2a神经细胞的损伤作用,找到最适合损伤浓度建立细胞损伤模型。(1)评价指标:细胞形态学、细胞凋亡率。(2)试验步骤:将N2a细胞分别与不同浓度的布比卡因0、600、900、1200、1500、20000μmol/L (C、B1、B2、B3、B4、B5 组)分别作用 6h、12h、24h、36h。光镜下观察细胞形态学变化;CCK-8法评价细胞存活率。每组实验重复3次。(三)实验二:明确GM-1对布比卡因诱导N2a神经细胞损伤的是否具有保护作用。阐述GM-1对布比卡因诱导N2a细胞损伤的可能保护机制。(1)评价指标:细胞形态学、细胞核固缩率、细胞凋亡率、细胞凋亡因子Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的 mRNA和蛋白的表达水平。(2)试验步骤:将N2a细胞用不同浓度0.001、0.01、0.1、1、1Oμmol/L(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5组)的GM-1预处理24h后均再加入布比卡因(900 μmol/L)继续作用12 h,建立好细胞实验模型。光学显微镜下观察细胞形态学改变;采用CCK-8法评价N2a神经细胞存活率;Hoechst 33258荧光染色法检测细胞核固缩率;以流式细胞仪技术AnnexinV-FITC/PI双染方法检测细胞凋亡率;以RT-PCR和Westernblot法测定不同浓度GM-1对损伤细胞神经元caspase-3、csapase-8、caspase-9基因的mRNA和蛋白的表达水平。每组实验重复3次。结果(1) CCK-8法检测结果表明,布比卡因能够降低N2a存活率,布比卡因浓度越大、作用时间越长,其神经毒性作用越强,具有剂量和时间的双重依赖性。确定布比卡因诱导致N2a神经细胞损伤的最适有效浓度和时间为900μmol/L 培养 12h。(2) GM-1对布比卡因的神经损伤具有显著保护作用,其保护作用与剂量有关,本实验的最大保护浓度为1Oμmol/L。光学显微镜下布比卡因组N2a细胞形态改变明显、细胞存活率显著下降、细胞凋亡率和细胞核固缩率明显增加。上述指标的结果均显示A组和BG1、BG2、BG3、BG4、BG5组的细胞凋亡率和细胞核固缩率明显低于B组,差异有统计学意义(P<0. 05),与A组比较,BG5组凋亡率和核固缩率无明显差异(P>0. 05), A组细胞凋亡率和核固缩比率低于BG2、BG3、BG4各组(P<0.05) ; BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各组间比较,凋亡率和核固缩率随着GM-1浓度的增大而减小,差异有统计学意义(P<0. 05)。(3)布比卡因产生的神经毒性与线粒体途径的细胞凋亡有关。GM-1预处理可以抑制布比卡因产生的神经毒性。A组、B组和GM-1预处理保护组(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5 组)的细胞均有 Caspase-3、caspase-9 的 mRNA和蛋白的表达,但各组细胞对应的表达水平都存在差别;B组mRNA和蛋白表达量高于A组和BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各组,组间差异有统计学意义(P<0.05),与A组比较,BG5组表达量无明显差异(P>0.05); A组mRNA和蛋白表达量低于低于BG2、BG3、BG4各组(P<0. 05) ; BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各组间比较,表达量随着GM-1浓度的增大而减小,差异有统计学意义(P<0. 05)。A组、B组和GM-1预处理保护组(BG1、BG2、BG3、BG4、BG5各组)的caspase-8的表达量无明显变化,各组间差异无统计学意义(P>0. 05)。结论布比卡因对N2a神经细胞具有损伤作用,呈剂量和时间双重正性相关,GM-1对布比卡因的神经损伤具有显著保护作用,其作用主要是通过调控凋亡因子的表达,即凋亡因子Caspase-3和Caspase-9表达下调来实现的。