论文部分内容阅读
背景：在个体发育过程中，下丘脑－垂体－性腺(HPG)轴系在这一复杂生理过程中起着主导作用。HGP轴系是男女两性获得正常生殖功能的基础。下丘脑GnRH规律脉冲释放是青春期启动的标志。有许多神经肽和神经递质参与GnRH的调控，NMDA、NO、leptin等对GnRH有正调作用，而NPY和GABA等具有负调控作用。同时GnRH的转录还受到性腺类固醇激素的负反馈调控。KiSS-1是在哺乳动物新发现的参与GnRH调控的基因，GPR54是KiSS-1编码产物的受体。GPR54受体突变的个体可以发生原发性低促性腺激素性性腺功能低下(IHH)，KiSS-1和GPR54可能与青春期启动密切相关。KiSS-1和GPR54在生殖调控中的功能和机制研究相对较少，对其研究可以完善我们对于青春期启动和生殖调控机制的认识，为生殖调控和异常疾病的治疗寻找新的靶点。目的：1．下丘脑是生殖内分泌调控的中枢。利用分子生物学的方法，检测大鼠下丘脑的KiSS-1的表达，评价其对GnRH神经元的促进作用。2．进一步探讨KiSS-1调控GnRH可能的机制，从而在机制上解释KiSS-1和GPR54与发育的关系。3．检测大鼠睾丸中KiSS-1和GPR54的表达，分析其在性腺可能的直接的作用，从而探讨KiSS-1和GPR54在整个下丘脑－垂体－性腺轴系的功能。方法：1．观察不同发育阶段雄性大鼠下丘脑KiSS-1、GPR54和GnRHmRNA表达，探讨KiSS-1在性发育的启动和正常生殖功能调节中的作用。检测雄性大鼠kisspeptin脑室注射后，化学发光法检测血清中睾酮的变化。2．成年雄性大鼠脑室注射kisspeptin后，用RT-PCR和定量PCR等方法，检测下丘脑GnRH mRNA的表达及垂体FSH-β和LH-βmRNA表达变化。3．雄性去势青春期大鼠腹腔注射40mg／BW NMDA或1mg／BWMK-801，与盐水注射大鼠对照，比较下丘脑KiSS-1 mRNA表达。4．免疫组化方法检测不同发育阶段雄性大鼠睾丸中KiSS-1和GPR54的表达。5．统计学方法：将上述检测指标运用SPSS 11.5软件进行统计学比较。结果：1．从RT-PCR结果表明随发育过程大鼠下丘脑的KiSS-1 mRNA转录水平逐渐升高，到性发育期水平最高，成年期略下降，但保持相对较高水平。未发育期、发育早期、性发育期和性成熟期大鼠KiSS-1 mRNA水平分别是幼年时的1.7、2.1、3.5、2.0倍。从real-timePCR结果对GnRH和KiSS-1转录水平相关分析显示，在发育过程中，GnRH与KiSS-1表达变化正相关，GnRH神经原转录激活晚于KiSS-1。GnRH在性发育期转录水平最高，未发育期、发育早期、性发育期和性成熟期表达水平分别是幼年时的1.1、1.9、2.4、1.9倍。GPR54在发育各阶段都有表达，幼年期和未发育期基因转录水平显著低于性发育期和性成熟期。2．大鼠侧脑室注射(icv)1nmol kisspeptin后，未检测到GnRH mRNA转录水平升高，垂体FSH-β和LH-βmRNA水平显著升高。Kisspeptin注射2h后，大鼠血清睾酮水平显著升高。3．与生理盐水对照组相比，NMDA腹腔注射后，下丘脑KiSS-1mRNA表达下降；而MK-801注射后，KiSS-1基因转录水平升高。4．免疫组化示睾丸中有KiSS-1和GPR54的表达，免疫反应性都定位于生精细胞，间质细胞无表达。在性发育期睾丸KiSS-1和GPR54表达最高，未发育期表达最低。结论：1．KiSS-1及其受体GPR54是调控性腺轴系功能的因素之一，虽然本文未发现KiSS-1显著影响GnRH基因转录水平，但kisspeptin可能显著促进GnRH蛋白(10肽)水平的表达与释放，表现为LH和FSH表达增加，外周血睾酮水平升高。2．KiSS-1表达与GnRH表达具有正相关性，其可能参与GnRH的调控，与性发育启动和生殖功能调控有关。KiSS-1及GPR54的表达与性发育相关，在发育期表达最高，因此与性发育启动有关。3．兴奋性氨基酸可以直接或间接的调控KiSS-1基因转录活动。NMDA对KiSS-1具有负调作用，其非竞争性受体拮抗剂可以上调KiSS-1表达。表明KiSS-1位于NMDA的下游，可能介导NMDA等其他调控因子对GnRH的调控作用。4．KiSS-1及其受体GPR54在睾丸中生精细胞表达，可能调控生精细胞的成熟过程。表明KiSS-1和GPR54在性腺可能具有直接的生理作用。